大鼠心肌缺血-再灌注损伤miRNA-214介导电针预处理的保护作用

柳培雨,田　毅,鲍缦夕,王　玥,崔　芬



大鼠心肌缺血-再灌注损伤miRNA-214介导电针预处理的保护作用

柳培雨1,田毅2,鲍缦夕3,王玥1,崔芬1

目的评估miRNA-214介导电针预处理对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用。方法雄性SD大鼠24只随机分为四组(n=6)：假手术组(Sham组)、Sham+电针组(sham+EA)、缺血-再灌注组(I/R组)、缺血-再灌注+电针组(I/R+EA组)。Sham+EA组、I/R+EA组在心肌缺血-再灌注损伤实验前3 d，每天给电针预处理。I/R组及 I/R+EA组行心肌缺血-再灌注造模。监测Sham组、sham+EA组、I/R组及 I/R+EA组大鼠的心功能指标，并测量心肌梗死面积。检测乳酸脱氢酶、肌酸激酶活性，以及心肌细胞中miRNA-214的表达情况。结果与sham组比较，I/R组心功能指标均降低。I/R+EA组与I/R 组比较心功能指标均有所提高。I/R+EA组心肌梗死面积显著小于I/R组。而I/R组乳酸脱氢酶、肌酸激酶活性显著升高并高于I/R+EA组(P<0.05或P<0.01)。Sham组、sham+EA组 I/R组及 I/R+EA组大鼠的miRNA-214的表达分别为1、1.6、1.75和2.82，I/R组miRNA-214的表达高于sham组，电针预处理增加了sham+EA组和I/R+EA组的miRNA-214表达(P<0.01)。结论miRNA-214表达上调机制参与电针预处理对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的心脏保护作用。

心肌缺血-再灌注损伤； miRNA-214；电针；保护作用

心肌缺血-再灌注损伤性疾病正伴随社会老龄化加剧而持续增加。自1986年心肌缺血预处理概念首次提出以来，预处理概念在医学领域广为应用。国内外已有一些学者进行了电针预处理技术应用于心脏保护的相关研究，并证实了此法的可行性。所谓电针疗法是神经电刺激的物理疗法与中医针灸疗法相结合而形成的，是指在中医毫针的基础上，使用脉冲发生器在针上通以接近人体生物电的微量电流波，以对机体实施持续、稳定、精确、可控的电刺激，产生电生理效应以获得疗效[1]。基础研究已经证实，单独“内关”穴电针治疗对心肌缺血有显著疗效，然而电针对心脏保护作用的可靠机制尚未明确。微小核糖核酸-214(miRNA-214)是一系列心脏应激的敏感标志物，它在心脏肥大、心肌梗死、心肌缺血-再灌注和心脏衰竭时表达均上调，并发挥抗心肌保护作用。本研究旨在评估电针预处理对心肌缺血-再灌注损伤发挥保护作用，并评估是否有miRNA-214表达增强的机制参与其中。

1　材料与方法

1.1材料雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(280～300 g，广州赛业公司提供)24只随机分为4组，每组6只。假手术组(Sham组)、Sham+电针组(sham+EA)、缺血-再灌注组(I/R组)、缺血-再灌注+电针组(I/R+EA组)。Sham+EA组、I/R+EA组大鼠在心肌缺血-再灌注损伤实验前3 d，每天给予双内关穴4/20 Hz， 0.5 ms， 1 mA持续电针刺激30 min。I/R组及 I/R+EA组大鼠麻醉后结扎冠状动脉左前降支(LAD)制作心肌缺血-再灌注模型，行缺血40 min，再灌注180 min。Sham组接受相同手术，但未行LAD结扎。

1.2心肌缺血-再灌注模型构建SD大鼠以3.5%水合氯醛50 ml/kg腹腔注射麻醉后，取背位固定于手术台上。颈胸部去毛后皮肤消毒。于颈部正中切开皮肤，钝性分离肌肉并暴露气管，于气管下穿线备用，用眼科剪在气管上剪一倒T形口，将3.0号气管导管插入气管并固定后，连接动物呼吸机机械通气，呼吸参数为呼吸频率潮气量为20 ml/kg，50 次/min，吸呼时比1∶1。逐层缝合颈部肌肉、皮肤。将大头针刺入四肢皮下并连接心电监护仪。稳定5～10 min后记录一段正常心电图作为对照。行股静脉穿刺，股部切开皮肤，小心分离股静脉，其下穿线备用。远心端结扎，在股静脉上用眼科剪剪一小口，将充有肝素抗凝的穿刺管小心插入股静脉，随后收紧结扎线固定穿刺管，之后将切口覆盖盐水纱布保护。开胸结扎LAD，于胸骨左侧2 mm切开皮肤，钝性分离肌肉显现肋骨，在第四肋间隙用眼科剪轻轻向下分离肋间肌，剪断左侧第3、4肋骨后，用拉钩拉开胸壁，在两侧胸壁肌肉分别穿入一双线，小心剪开心包膜，在左心耳下缘3～4 mm进针约1.5 mm，斜向右上方肺动脉圆锥方向进针，针距3～4 mm，分别将线两端穿入小圈内并扎紧。立即观察心电图，若出现宽大畸形QRS波即为结扎成功标志，记录心肌缺血开始时间，40 min后拉松结线，打开血管以实施心肌再灌注，立即观察心电图，数分钟后出现QRS波回落变窄，再灌注180 min。之后获取大鼠心脏。Sham组仅在LAD位置取同样大小的针缝针但不打结，其他操作同手术组。

1.3电针预处理将两支不锈钢毫针刺入大鼠“内关”穴，即尺、桡骨缝间，距腕关节约3 mm处。两毫针分别连接G6805-2电针治疗仪(上海医用电子仪器公司)的正、负电极，在心肌缺血-再灌注损伤实验前3 d，每天给予大鼠持续电针刺激30 min。电针刺激频率为4/20 Hz，脉冲密度为0.5 ms，强度1 mA，即以大鼠前爪轻颤为度。

1.4监测指标在再灌注180 min时，监测Sham组、sham+EA组 I/R组及 I/R+EA组大鼠的心率(HR)、平均动脉压(MAP)、左室舒张末压(LVSP)、最大左室压上升/下降速率(±dp/dt)max 等心功能指标；采用伊文思蓝(EB)/氯化三苯四氮唑(TTC)双重染色，称重法测定心肌梗面积；测定血液乳酸脱氢酶 (LDH) 和肌酸激酶 (CK)浓度；miRNA-214定量实时聚合酶链反应(qPCR)分析。

2　结　　果

2.1电针预处理后心功能指标得到改善再灌注180 min时，Sham组、sham+EA组 I/R组及 I/R+EA组的HR、MAP、LVSP、±dp/dt max 等心功能指标见表1。结果表明，Sham组与sham+EA组心功能指标差异无统计学意义。与sham 组比较，I/R组上述心功能指标均降低(P<0.05)。而电针预处理组能够有效缓解心功能损伤。I/R+EA组与I/R 组比较心功能指标均有所提高(P<0.05)。

表1　各组大鼠电针预处理心肌缺血-再灌注损伤后心功能指标比较　(n=6；±s)

注：与sham比较，①P<0.05；与I/R组比较，②P<0.05

2.2电针预处理后心肌梗死面积缩小图1显示，心肌I/R损伤后梗死的大小。I/R+EA组心肌梗死面积显著小于I/R组(P<0.05)。

图1　I/R组与I/R+EA组大鼠电针预处理使心肌缺血-再灌注损伤后心肌梗死面积的比较与I/R组比较，①P<0.05

2.3电针预处理导致LDH和CK活性升高大鼠血清LDH和CK活性检测结果显示，与sham组比较，sham+EA组血清LDH 活性未发生变化，而I/R组LDH 活性显著升高并高于I/R+EA组(P<0.01)。同样，I/R组CK活性也显著升高并高于I/R+EA组(P<0.05)。提示电针预处理能够有效抑制I/R损伤所导致的LDH和CK活性升高(图2)。

图2　各组大鼠电针预处理抑制心肌缺血-再灌注损伤所致LDH和CK活性升高比较

与sham组比较，①P<0.05，②P<0.01；与I/R组比较，③P<0.05，④P<0.01

2.4miRNA-214与电针抗心脏I/R 损伤的心脏保护作用有关如图3所示，与sham组比较，I/R组miRNA-214的表达增加(P<0.01)。电针预处理增加了sham+EA组和I/R+EA组的miRNA-214表达。

图3　心肌组织中miRNA-214 表达水平的qPCR分析与sham组比较，①P<0.01；与I/R组比较，②P<0.01

3　讨　　论

电针预处理是物理疗法与中医针灸理论相结合的预处理方法。已有多项研究证明，某些种类的电针预处理方法在心、脑等重要脏器的保护方面，具有积极作用。多项基础实验结果表明，电针预处理与心肌缺血预处理对于心肌缺血-再灌注损伤具有相似的保护效果。电针预处理心肌保护作用的可能机制研究较多，迄今为止电针预处理心肌保护机制尚未明确。大多数学者认为，电针预处理对心脏的保护作用与心脏释放内源性心肌保护物质有关。电针预处理在心肌能量代谢方面的研究发现，电针刺激内关等穴位可改善心肌细胞能量代谢，抑制心肌缺血时发生的ATP 减少、ATP/ADP 比值下降、糖酵解增强、乳酸无和机磷含量增加、细胞内PH下降、线粒体膜结构破坏等病理生理反应；与之同时尚可显著增加心肌糖原、ATP酶和琥珀酸脱氢酶(SDH)活性，使缺血心肌细胞能量代谢和缺血、缺氧状态得以相对缓解和改善。同时，有研究发现双侧穴位电针预处理的上述心肌保护作用优于单侧[2-4]。

研究显示，电针预处理可减少心肌缺血-再灌注损伤时，CK、LDH等心肌酶的含量，减低降钙素基因相关肽、前列素F2、血栓素B2、内皮素-1的含量。使缺血血管内皮生长因子合成增加，使微动脉舒张，继而增加局部血流量并使血压下降，从而减轻再灌注时心肌细胞损伤[5,6]。此部分实验，通过建立大鼠心肌缺血-再灌注模型并观察到，双内关穴电针预处理能够减小心肌梗死面积，保护心功能，以及降低血清LDH和CK活性。

微小核糖核酸(miRNAs)是一类内源性的小核苷酸片段，大约30%的人类基因受miRNAs的调节。其中miRNA-214在缺血性心肌病等心血管疾病的病理生理过程中发挥着重要作用。miRNA-214在缺血-再灌注时损伤时可抑制活性氧和随后的大量心肌细胞凋亡[7,8]。研究表明，miRNA-214在大鼠缺血心脏的梗死区及边缘区的表达均有所上调，而且心肌细胞中的活性氧刺激对于miRNA-214过表达来说十分敏感，同时具有浓度依赖性，再灌注时心肌细胞内miRNA-214的表达随活性氧浓度的增加而逐渐增加[9-13]。miRNA-214表达上调可以有效抑制由活性氧诱导的心肌细胞凋亡，反之当其表达下调时可以增加心肌细胞凋亡率。说明miRNA-214在心肌细胞中对发挥抗活性氧诱导的心肌细胞有凋亡作用[14-17]。

miRNA-214的人类第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)相关机制抗心肌细胞凋亡中的作用的相关研究发现，PTEN 是 miRNA-214 发挥抗活性氧心肌细胞损伤的作用靶点之一，PTEN 通路机制是miRNA-214在心肌缺血-再灌注损伤时发挥心脏保护作用的重要机制之一。同时相关研究发现，miRNA-214的低氧诱导因子1α抑制剂(HIF1AN)机制在心肌缺血-再灌注损伤时具有一定的保护作用。缺氧时低氧诱导因子1(HIF1)的过量生成对缺血-再灌注心肌具有损伤作用。miRNA-214可通过HIF1AN抑制HIF1-α而降低HIF1的DNA结合活性，参与缺血-再灌注损伤时的心脏保护作用[18-20]。

本研究结果表明，在缺血心肌中miRNA-214表达上调时，心脏收缩及舒张功能可得到明显改善，可使左室收缩压、压力最大上升/下降速率的损害相对减少，左室舒张末压、左室内径、心率、心室重构受损程度相对较低。与笔者前期相关心肌细胞体外预处理诱导miRNA-214表达上调，可显著改善缺血-再灌注时的心肌细胞功能的研究结果相似[6]。

综上所述，本研究通过建立大鼠心肌缺血-再灌注模型来检测电针预处理对在体及体外缺血-再灌注损伤的作用。研究结果显示，电针预处理通过上调miRNA-214表达发挥心脏保护作用。

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(2015-04-06收稿2015-09-18修回)

(责任编辑岳建华)

miRNA-214 was involved in cardioprotection by electroacupuncture pretreatment of myocardial ischemia/ reperfusion injury in rats

LIU Peiyu1, TIAN Yi2, BAO Manxi3,WANG Yue1, and CUI Fen1.

1.Department of Anesthiology, 3. Hospital Office, Hainan Municapal Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Haikou 570203, China; 2. Department of Anaesthesiology，Haikou Hospital，Xiangya Medical College，Central South Univercity，Haikou 570208，China

ObjectiveTo evaluate whether miRNA-214 mechanism was involved in the cardioprotection by electroacupuncture pretreatment of myocardial ischemia/ reperfusion injury in rats. Methods24 male SD rats were divided into 4 groups randomly (n=6): control group (sham group), sham + electric acupuncture group (Sham+EA) group, ischemia/reperfusion group (I/R group), ischemia/reperfusion + electric acupuncture group (I/R + EA group). Rats in group sham+EA and I/R+EA received electroacupuncture stimulation 30 min per day for 3 days before myocardial ischemia/reperfusion injury. Rats in group I/R and I/R+EA received left anterior descending (LAD) occlusion for 40min and reperfusion for 180 min. The indices of the cardiac function, myocardial infarct size , LDH and CK activities as well as expression of miRNA-214 were measured. ResultsAll the indices of the cardiac function were not significantly different between the sham and the sham+EA group. Compared with the sham group, all the indices of the cardiac function decreased significantly in I/R group (P<0.05). I/R+EA group showed that all the indices of the cardiac function increased, compared with I/R group. Myocardial infarct size in I/R+EA group significantly decreased, compared with I/R group. The activity of LDH and CK in of I/R group significantly increased, compared with I/R+EA group (P<0.05 orP<0.01). The expression of miRNA-214 in sham, sham+EA, I/R and I/R+EA group were 1, 1.6, 1.75 and 2.82, separately. The expression of miRNA-214 in the I/R group was higher than in sham group. Electroacupuncture pretreatment increased miR - 214 expression in sham + EA group and the I/R + EA group. ConclusionsElectroacupuncture pretreatment can protect the heart against myocardial ischemia/ reperfusion injury and can promote the expression of miRNA-214 in rats.

I/R injury; miRNA-214; electroacupuncture; protective effect

海南省自然基金项目(编号：20158326)

柳培雨，博士，副主任医师。

570203海口，武警海南总队医院:1.麻醉科, 3.院办； 2.570208海口，中南大学湘雅医学院附属海口医院麻醉科

田毅，E-mail：tianyi1975@126.com

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