丙泊酚对脂多糖诱导的小胶质细胞肿瘤坏死因子-α表达的影响

冯社军　王慧娟　武艳强　李军涛

(邯郸市中心医院神经内科，河北　邯郸　056001)



丙泊酚对脂多糖诱导的小胶质细胞肿瘤坏死因子-α表达的影响

冯社军王慧娟武艳强1李军涛

(邯郸市中心医院神经内科，河北邯郸056001)

目的探讨丙泊酚能否通过抑制核因子(NF)-κB活化下调脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达。方法将BV2细胞分为4组即对照组、丙泊酚组、丙泊酚+LPS组和LPS组。在干预0 h和24 h时使用MTT法检测BV2细胞活性。在干预24 h后使用RT-PCR法和Western印迹法对BV2细胞TNF-α mRNA和蛋白的表达水平进行检测；并使用Western印迹法对细胞NF-κB p65磷酸化水平(phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值)进行分析。结果在给予LPS干预24 h后BV2细胞活性明显降低(P均<0.05)；但丙泊酚+LPS组细胞活性较LPS组增加(P均<0.05)，同时对照组和丙泊酚组细胞活性无统计学差异(P均>0.05)。与对照组相比较，在LPS干预24 h后BV2细胞TNF-α mRNA和蛋白的表达水平以及phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值均明显升高(P均<0.05)；但LPS组较丙泊酚+LPS组TNF-α表达的升高以及phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值的增加更加显著(P均<0.05)；同时对照组和丙泊酚组TNF-α表达水平和phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值无统计学差异(P均>0.05)。结论丙泊酚可能通过抑制NF-κB的激活下调了BV2细胞TNF-α合成和释放。

丙泊酚；BV2细胞；肿瘤坏死因子-α；核因子-κB

炎症反应在脑卒中导致的神经元损伤过程中扮演着重要的角色〔1～4〕。小胶质细胞作为神经组织中主要的固有免疫细胞，是脑卒中相关炎症反应的最重要的参与者和效应细胞。过度活化的小胶质细胞可大量释放一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6等炎症介质和部分神经毒性物质，直接导致神经元坏死和诱导神经元的凋亡，同时还可使血管内皮细胞通透性增加导致脑水肿的发生〔5～7〕。基础研究发现该过程与核因子(NF)-κB的活化密切相关〔6～8〕，而有研究表明丙泊酚可通过抑制NF-κB活化减轻炎症反应〔9，10〕。故本文探讨丙泊酚能否通过抑制NF-κB活化下调脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞TNF-α表达。

1　材料与方法

1.1主要试剂和材料PCR试剂盒购自宝生物工程有限公司；丙泊酚购买于英国阿斯利康公司；兔抗鼠TNF-α抗体、兔抗鼠NF-κB p65抗体、兔抗鼠phospho-NF-κB p65抗体和兔抗鼠β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司；DMEM培养基(美国Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，MTT试剂盒(美国Promega公司)，超纯水。其余试剂均为分析纯。

1.2细胞培养小胶质BV2细胞常规接种在含10%胎牛血清、100 g/L青霉素、100 g/L链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃、95%空气、5%CO2孵箱内培养。每48 h换液、传代2次，取对数生长期细胞用于实验。BV2细胞分为照组、丙泊酚组、丙泊酚+LPS组和LPS组。其中对照组细胞加入PBS；LPS组和丙泊酚+LPS组加入LPS (1 μg/ml)；丙泊酚+LPS组和丙泊酚组加入50 μmol/L的丙泊酚溶液进行干预。

1.3细胞活性分析(MTT比色试验)取对数生长期细胞消化制成单细胞悬液，接种于96 孔培养板中，每孔接种100 μl约含5×103个细胞。贴壁后无血清培养细胞16～24 h，使细胞同步化。使用MTT比色试验对0 h和24 h时的细胞生长状态进行测定，重复实验4次。细胞活性(%)=OD干预组/OD对照组×100%〔11〕。

1.4细胞TNF-α mRNA表达检测干预24 h后，按照RT-PCR试剂盒说明书提取细胞总RNA。引物：TNF-α正义5′-AAATTCGAGTGACAAGCCTGTAG-3′，反义5′-GAGAACCTGGGAGTAGACAAGGT-3′和β-actin正义：5′-CGAGCGGGCTACAGCTTC-3′，反义：5′-GTCACGCACGATTCCC-TCT-3′。按照试剂盒说明书介绍进行反转录和扩增实验。应用凝胶成像系统(Bio-rad)摄影，Quantity One软件对目的条带进行扫描分析。用与β-actin PCR产物条带灰度比值作为TNF-α mRNA的相对表达量。

1.5Western印迹法检测细胞中TNF-α蛋白表达和NF-κB p65活化水平干预24 h后，按照试剂盒操作要求，首先提取细胞总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1 h，分别加入兔抗鼠TNF-α抗体(1∶700)、兔抗鼠phospho-NF-κB p65抗体 (1∶800)、 兔抗鼠NF-κB p65抗体(1∶800)和兔抗鼠β-actin抗体(1∶1 200)，4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)，用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。

1.6统计学方法采用SPSS17.0统计学软件进行单因素方差分析。

2　结　果

2.1细胞活性分析在给予LPS (1 μg/ml)干预24 h后BV2细胞活性明显降低(P均<0.05)；但丙泊酚+LPS组细胞活性较LPS组增加(P均<0.05)，同时对照组和丙泊酚组细胞活性无统计学差异(P均>0.05)。见表1。

表1　MTT比色法测定BV2细胞活性

与对应时点对照组比较：1)P<0.05；对应时点LPS组比较：2)P<0.05

2.2TNF-α mRNA和蛋白的表达与对照组比较，BV2细胞在LPS干预后TNF-α mRNA和蛋白的表达水平明显升高(P均<0.05)。但LPS组较丙泊酚+LPS组TNF-α mRNA和蛋白的表达升高更加显著(P均<0.05)，同时发现对照组和丙泊酚组TNF-α表达水平无统计学差异(P均>0.05)。见图1和表2。

1～4：对照组、丙泊酚组、丙泊酚+LPS组、LPS组，下图同图1　BV2细胞TNF-α表达的RT-PCR和Western印迹结果

2.3NF-κB p65活化水平与对照组相比较，BV2细胞在LPS干预后phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值水平明显升高(P均<0.05)。但LPS组较丙泊酚+LPS组phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值水平升高更加显著(P均<0.05)，同时发现对照组和丙泊酚组phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值水平无统计学差异(P均>0.05)。见图2和表2。

表2　BV2细胞TNF-α mRNA和蛋白的表达水平及NF-κB p65活化水平

与对照组比较：1)P<0.05；与LPS组比较：2)P<0.05

图2　BV2细胞NF-κB p65活化的Western印迹结果

3　讨　论

由于动脉粥样硬化、原发性高血压、糖尿病和心房颤动等慢性疾病的发病人数持续增多，缺血性和出血性脑卒中发病率也明显上升〔1～4，12〕。目前认为急性脑梗死治疗的主要目的之一是改善缺血半暗带潜在可挽救的缺血的脑神经组织和细胞，防止继发性损害的产生。小胶质细胞分布于中枢神经系统，数量约占神经胶质细胞总数的5%～10%，其体积最小，在脑组织中广泛分布，以海马、嗅叶和基底神经节处分布最为丰富，丘脑和下丘脑次之，脑干和小脑数量最少。一般状况下小胶质组胞处于静息和休眠状态。当脑卒中发生时小胶质细胞迅速活化，从静止的分支样转变为活化的阿米巴样的形态，大量的表面分子迅速上调，包括CD14、主要组织相溶细胞(MHC)、趋化因子受体和其他一些活化标记分子〔5～7，13，14〕。

目前大量的研究发现丙泊酚具有独立于镇静镇痛以外的炎症抑制作用〔15～18〕。Peng等〔16〕的研究发现丙泊酚可以有效抑制LPS诱导的胶质细胞的炎症反应。Ma等〔18〕的研究也证实丙泊酚对LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤有保护作用。同时由于TNF-α作为体内最重要的促炎症介质在包括脑卒中在内的多种炎症性疾病中发挥重要的生物学作用，研究发现神经组织中TNF-α可直接和间接地诱导小胶质组胞活化，并促进其吞噬功能，同时还可促进其他炎症介质的释放和导致脑组织中血管内皮细胞的损伤和通透性的增加〔19，20〕。抑制和下调TNF-α可以有效改善脑卒中导致的炎症反应，改善预后。本研究结果表明丙泊酚具有抑制炎症状态下BV2细胞TNF-α合成和释放的作用。

NF-κB在包括脑卒中导致的炎症反应等多种炎症过程中扮演着极为重要的角色。非激活状态下NF-κB以非磷酸化的形式存在于细胞质中；在炎症和应激等状态下NF-κB迅速磷酸化形成二聚体，并核转位与具有κB结合序列的靶基因结合导致转录活性的增加。同时TNF-α转录活性调节区存在κB结合序列，NF-κB是TNF-α最重要的转录调节因子之一。Li等〔15〕研究发现在间歇性缺氧状态下丙泊酚可以通过选择性抑制NF-κB的活化抑制MAPK p38信号通路减轻人血管内皮细胞的损伤。同时Hsing等〔17〕也证实丙泊酚有效地减轻了LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症反应和氧化应激，并发现该过程与下调NF-κB活化密切相关。本研究结果表明丙泊酚可有效抑制LPS诱导的BV2细胞NF-κB的活化水平。

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〔2015-02-16修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

河北省卫生厅重点科技研究计划(20130359)

李军涛(1972-)，男，硕士，主任医师，主要从事脑血管病研究。

冯社军(1980-)，男，硕士，副主任医师，主要从事脑血管病研究。

R39

A

1005-9202(2016)18-4407-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.002

1邯郸市中心医院心血管内科