慢性乙型肝炎患者CD14highCD16+单核细胞表达特点研究

黄昂 闫伟伟 张纪元 王福生 邹正升



·论 著·

慢性乙型肝炎患者CD14highCD16+单核细胞表达特点研究

黄昂 闫伟伟 张纪元 王福生 邹正升

目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中CD14highCD16+单核细胞频率、功能特点以及与疾病进程之间的关系。方法 利用荧光抗体标记结合多色流式技术，检测CHB患者外周血CD14highCD16+单核细胞频率及表面TLR2分子的表达，用LPS刺激及细胞内染色方法检测CHB患者外周血CD14highCD16+单核细胞产生细胞因子的能力。结果 CHB患者外周血的CD14highCD16+单核细胞频率明显高于健康对照；CHB患者CD14highCD16+单核细胞频率与ALT呈负相关(R=0.739,P<0.01)，与HBV DNA载量成正相关(R=-0.283,P=0.008)；CHB患者外周血CD14highCD16+单核细胞上TLR2的表达高于其他两个亚群；免疫活化CHB患者外周血在LPS刺激后，CD14highCD16+单核细胞亚群分泌IL-6的能力均高于CD14highCD16-和CD14lowCD16+单核细胞亚群。结论 CD14highCD16+单核细胞可能在清除肝炎病毒及肝脏免疫损伤中起重要作用。

慢性乙型肝炎；CD16；Toll样受体2；单核细胞

HBV感染慢性化机制复杂，特异性T细胞损伤是HBV持续性感染的重要特征。越来越多的证据表明，固有免疫在病毒持续性感染过程中同样扮演重要角色。HBV慢性感染时，巨噬细胞和树突状细胞的功能均存在障碍[1]。巨噬细胞和树突状细胞在炎症情况下，是由循环血液中的单核细胞发育而来。成熟单核细胞均表达CD14分子，源于骨髓中的髓系干细胞，根据表面分子CD16的表达情况，可分为两大亚群，即经典单核细胞(CD16-)和非经典的单核细胞(CD16+)[2]。既往认为CD16+单核细胞是单一型亚群，但随着研究的深入，发现CD14+CD16+单核细胞是一群异质性的细胞，根据CD14表达的高低，又可继续分为表型和功能均不同的两个亚群，即CD14highCD16+(又称CD14++CD16+)和CD14lowCD16+(又称CD14dimCD16+)单核细胞[3]。其中CD14highCD16+单核细胞，表达更高水平的CD163与HLA-DR[4-5]，目前认为可能与疾病进程密切相关。本研究采用多色流式细胞技术检测慢性乙型肝炎患者外周血CD14highCD16+单核细胞的表达，以探讨慢性HBV感染中CD14highCD16+单核细胞的表达特点及临床相关性。

资料和方法

一、病例选择

解放军第三〇二医院收治的临床确诊慢性乙型肝炎(CHB)患者86例，男61例，女25例，年龄18～55岁。诊断标准均符合中华医学会肝病学分会和感染病学分会联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》。入组前6个月内未经任何抗病毒及免疫抑制剂治疗，入院前1个月内未行保肝降酶治疗，排除合并细菌感染、其他肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病或其他重大疾病等。健康对照18例，均为健康献血者。进一步将CHB患者分为免疫耐受期22例(HBV DNA>107IU/mL，ALT/AST正常)和免疫清除期64例(HBV DNA 阳性，但一般低于免疫耐受期，ALT/AST持续或间歇升高，肝组织学有坏死炎症等表现)。

二、主要试剂与仪器

荧光标记小鼠抗人单克隆抗体CD14-APC、CD16-FITC、TLR2-PE、IL-6-PE及相应同型对照和BD FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司生产。流式洗涤液为含0.5%BSA、0.1%NaN3的PBS。肝功能由日本Olympus生化分析仪检测，实时荧光定量RT-PCR检测血清中的HBV DNA，均由解放军第三○二医院临床检验中心完成。

三、流式细胞仪检测

新鲜肝素抗凝全血100 μL加入荧光单抗20 μL，并设置同型对照，混匀；室温避光孵育30 min；加红细胞裂解液，震荡后置之于离心机中，离心半径10 cm，1 500 r/min，离心5 min，弃上清液，加入2 mL PBS洗涤一次；1%多聚甲醛200 μL重悬固定，流式细胞仪检测。

四、全血刺激及细胞内因子染色

取新鲜肝素钠抗凝血300 μL，加680 μL含10% FBS的RPMI1640培养基，再加5 ng/μL LPS 20 μL，震荡混匀。封口并扎孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。1 h后分别加蛋白质转运抑制剂Monensin阻断，置于37℃二氧化碳培养箱继续培养5 h后取出。PBS洗涤重悬后，加CD14-APC、CD16-FITC各10 μL，震荡后避光20 min。加入红细胞裂解液2 mL，震荡，室温避光3 min。PBS洗涤后1 500 r/min离心5 min，弃上清。加入300 μL破膜剂，室温避光放置20 min，然后加1 mL破膜洗液，震荡后1 500 r/min离心5 min，弃上清。加入IL-6-PE 10 μL，震荡后避光20 min。加1 mL破膜洗液，震荡后1 500 r/min离心5 min，弃上清。加入1%多聚甲醛200 μL固定，流式细胞仪检测。

五、统计学分析

结 果

一、外周血中CD14highCD16+单核细胞数量及频率

免疫清除期患者的外周血单核细胞绝对值为(0.55±0.17)×109/L，高于免疫耐受期患者(0.43±0.11)×109/L和健康对照(0.45±0.14)×109/L，差异有统计学意义(P<0.05)，而免疫耐受期患者与健康对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。全血经多色荧光抗体染色后，由流式细胞仪检测，经红细胞裂解后外周血细胞群体分布清晰，通过光散射性质设定单核细胞区(以椭圆圈定，图1A)；单核细胞通过CD14和CD16分子表达强度分为CD14highCD16-、CD14highCD16+与CD14lowCD16+三个亚群(图1B)。进一步研究发现，免疫清除期患者外周血CD14highCD16+单核细胞(9.23±4.39)%明显高于健康对照组(4.79±1.56)%和免疫耐受患者(4.50±1.64)%，差异有统计学意义(P<0.01)，而健康对照组与免疫耐受患者之间差异无统计学意义(P>0.05)。

二、CHB患者外周血CD14highCD16+单核细胞与血清生化学、病毒学之间的关系

在CHB患者中，外周血CD14highCD16+单核细胞频率(以CD14highCD16+单核细胞占总单核细胞百分比表示)与血清ALT水平均成正相关(R=0.739,P<0.01)(图2A)。CD14highCD16+单核细胞频率与CHB患者血清HBV DNA取对数后成负相关(R=-0.283,P=0.008)(图2B)。ALT和病毒载量均是CHB患者重要的临床指标，CD14highCD16+单核细胞频率与这些临床指标都有着较好的相关性，说明CD14highCD16+单核细胞与CHB患者的疾病进程密切相关。

注：A. 外周血单核细胞圈门策略；B. 健康对照组、免疫耐受患者和免疫清除患者的单核细胞各亚群频率典型图

图2 CHB患者外周血CD14highCD16+单核细胞胞频率与ALT水平和HBV DNA载量之间的相关性

三、免疫清除患者外周血CD14highCD16+单核细胞表面TLR2分子的表达

通过流式细胞技术检测免疫清除患者外周血CD14highCD16+单核细胞TLR2的表达，以平均荧光强度表示外周血单核细胞各亚群表面TLR2分子的表达强度。本研究发现，免疫清除患者外周血CD14highCD16-、CD14highCD16+和CD14lowCD16+单核细胞TLR2的平均荧光强度分别为25.93±12.01、33.12±15.04和23.60±9.62。CD14highCD16+单核细胞亚群TLR2的表达强度明显高于其余两个亚群(均P<0.01)。

四、免疫清除患者外周血CD14highCD16+单核细胞分泌IL-6的特点

进一步采用细胞内因子染色方法，观察15例ALT明显升高(ALT>100 U/L)的免疫清除患者用LPS刺激后单核细胞各亚群分泌细胞因子功能的差异。免疫清除患者的CD14highCD16-、CD14highCD16+和CD14lowCD16+单核细胞亚群IL-6的平均荧光强度分别为200.28±126.55、230.39±134.48和94.30±63.77。CD14highCD16+单核细胞亚群分泌IL-6能力明显高于CD14highCD16-亚群(P<0.05)和CD14lowCD16+单核细胞亚群(P<0.01)。

讨 论

机体对HBV感染后的免疫应答包括固有免疫与适应性免疫应答。固有免疫是抗感染的第一道防线，参与固有免疫的细胞有多种。单核细胞是重要的固有免疫细胞，通过分泌数量众多的细胞因子，以主动和协同作用的方式招募炎性细胞，同时通过MHCⅡ分子给T细胞提呈抗原，引起后者的活化和增殖。单核细胞是一群异质性的细胞，主要由三部分组成，即CD14highCD16-、 CD14highCD16+和CD14lowCD16+，其中CD14highCD16+单核细胞可能与结核、类风湿性关节炎等多种疾病的进程有关[6-7]。本研究发现，CHB患者，特别是免疫清除患者，外周血CD14highCD16+单核细胞的频率及绝对值均显著升高，提示CD14highCD16+单核细胞与疾病的严重程度密切相关。

对CHB患者外周血中的CD14highCD16+单核细胞频率与患者的血清ALT和HBV DNA水平进行分析，发现外周血CD14highCD16+单核细胞频率与ALT呈正相关，而与HBV DNA载量呈负相关。这提示CD14highCD16+单核细胞的升高可能有利于限制HBV复制，与HCV中的结果相一致[3]，但不同于HIV中的结果[4]。而CD14highCD16+单核细胞与ALT呈正相关，提示其有可能在促进肝脏炎性反应中发挥着一定的作用。

固有免疫的触发以感知外来病原的存在为前提。病原体显示的抗原统称为病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)。PAMP由参与固有免疫的模式识别受体(pattern recognizingreceptor, PRR)所识别，PRR中的Toll样受体是目前研究的热点，而单核细胞主要表达TLR2，TLR2的识别谱广、生物学作用广泛，主要包括抵抗感染，引发炎性反应和促进抗原呈递细胞的成熟，启动固有性免疫应答，并在适应性免疫应答中起重要的调节作用[8]。本研究发现，免疫清除患者中，相对于其他亚群，CD14highCD16+单核细胞亚群高表达TLR2。进一步实验发现，用LPS刺激CHB患者的外周血后，CD14highCD16+单核细胞亚群IL-6的表达水平明显高于CD14highCD16-亚群和CD14lowCD16+单核细胞亚群。既往研究已经证实[9]，HBV核衣壳的核心抗原成分通过其富含精氨酸的片段与人巨噬细胞细胞膜上的硫酸乙酰肝素成分结合后，可以激活TLR2信号通路，使NF-kappaB活化，导致IL-6等的分泌。因而在CHB时，外周血CD14highCD16+单核细胞TLR2表达上调，可能是CD14highCD16+单核细胞分泌高水平的IL-6的机制。Bezemer等[10]的研究也证实，IL-6可以上调单核细胞TLR2的表达。IL-6既是免疫调节因子又是炎介质，能促进肝脏合成急性期蛋白，激活T淋巴细胞，诱导B淋巴细胞分化，在清除肝炎病毒及免疫损伤中起重要作用。以上结果提示，通过TLR2和IL-6之间表达的相互促进效应，CD14highCD16+单核细胞可能在CHB的发病和进展过程中发挥一定的作用。

[1] Wolk K, Hoflich C, Zuckermann-Becker H, et al. Reduced monocyte CD86 expression in postinflammatory immunodeficiency. Crit Care Med, 2007, 35: 458-467.

[2] Barlage S, Gnewuch C, Liebisch G, et al. Changes in HDL-associated apolipoproteins relate to mortality in human sepsis and correlate to monocyte and platelet activation. Intensive Care Med, 2009, 35: 1877-1885.

[3] Zheng J, Liang H, Xu C, et al. An unbalanced PD-L1/CD86 ratio in CD14(++)CD16(+) monocytes is correlated with HCV viremia during chronic HCV infection. Cell Mol Immunol, 2014, 11: 294-304.

[4] Han J, Wang B, Han N, et al. CD14(high)CD16(+) rather than CD14(low)CD16(+) monocytes correlate with disease progression in chronic HIV-infected patients. J Acquir Immune Defic Syndr, 2009, 52: 553-559.

[5] Waschbisch A, Schroder S, Schraudner D, et al. Pivotal Role for CD16+ Monocytes in Immune Surveillance of the Central Nervous System. J Immunol, 2016, 196: 1558-1567.

[6] Amoruso A, Sola D, Rossi L, et al. Relation among anti-rheumatic drug therapy, CD14(+)CD16(+) blood monocytes and disease activity markers (DAS28 and US7 scores) in rheumatoid arthritis: A pilot study. Pharmacol Res, 2016, 107: 308-314.

[7] Lastrucci C, Benard A, Balboa L, et al. Tuberculosis is associated with expansion of a motile, permissive and immunomodulatory CD16(+) monocyte population via the IL-10/STAT3 axis. Cell Res, 2015, 25: 1333-1351.

[8] Kawai T, Akira S. Antiviral signaling through pattern recognition receptors. J Biochem, 2007, 141: 137-145.

[9] Cooper A, Tal G, Lider O, et al. Cytokine induction by the hepatitis B virus capsid in macrophages is facilitated by membrane heparan sulfate and involves TLR2. J Immunol, 2005, 175: 3165-3176.

[10] Bezemer GF, Sagar S, van Bergenhenegouwen J, et al. Dual role of Toll-like receptors in asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Pharmacol Rev, 2012, 64: 337-358.

(本文编辑：钱燕)

Characterization and significance of CD14highCD16+monocytes in chronic hepatitis B patients

HUANGAng,YANWei-wei,ZHANGJi-yuan,WANGFu-sheng,ZOUZheng-sheng.

CenterofNon-infectiousLiverDiseases,PLA302Hospital,Beijing100039,ChinaCorrespondingauthor:ZOUZheng-sheng,Email:zszou302@163.com

Objective To investigate the expression characteristics of CD14highCD16+monocytes and its relationship with disease progression in patients with chronic hepatitis B virus (HBV) infection. Methods Immunofluorescent staining and flow cytometry assay were used to measure the frequency of CD14highCD16+monocytes and its expression of toll-like receptor 2 (TLR2) from CHB patients. Interleukin-6 (IL-6) production in CD14highCD16+monocytes stimulated with lipopolysaccharide (LPS) was also measured in CHB group. Results Frequency of CD14highCD16+monocytes in peripheral blood of CHB patients was significantly higher than those in health controls and CHB patients in immune tolerant phase. Proportions of circulating CD14highCD16+monocytes were positively correlated with serum alanine transaminase levels (R=0.739,P<0.01), while negatively correlated with HBV DNA loads (R=-0.283,P=0.008). CD14highCD16+monocytes showed increased expression of TLR2 compared with other subpopulations. After LPS stimulation, CD14highCD16+monocytes produced significantly more IL-6 than that in CD14highCD16-and CD14lowCD16+monocytes. Conclusion CD14highCD16+monocytes might play an important role in the pathogenesis of HBV-induced liver injury.

Chronic hepatitis B; CD16; TLR2; Monocytes

军队医学科技青年培育计划(15QNP084)

100039 北京 解放军第三○二医院非感染性肝病诊疗与研究中心(黄昂，闫伟伟，邹正升)，感染性疾病诊疗与研究中心(张纪元，王福生)

邹正升，Email：zszou302@163.com

2016-06-29)