拟南芥茎尖干细胞调控机制的研究进展

崔玉超,陈 亮

(厦门大学生命科学学院,厦门市植物遗传重点实验室,福建 厦门361102)

·综 述·

拟南芥茎尖干细胞调控机制的研究进展

崔玉超,陈 亮*

(厦门大学生命科学学院,厦门市植物遗传重点实验室,福建 厦门361102)

植物茎尖干细胞是位于植物顶端一团具有无限增殖能力的细胞,它是植物整个地上部分发育的源泉.干细胞分裂产生的子细胞一部分用来保持自我更替,另一部分形成器官原基,进而使其处于一种动态平衡状态,来维持植物甚至可长达千年的生长周期.现代分子生物学与遗传学表明这种动态平衡的维持受到来自干细胞微环境的各种因素的精确调控.其中起核心作用的是由WUSCHEL(WUS)基因与CLAVATA(CLV)基因之间形成的负反馈调节环,而其他生物学因素如细胞分裂素、可以移动的小RNAs和表观遗传作用等最终都作用于这一负反馈调节环,另外与WUS-CLV信号通路相平行的SHOOTMERISTEMLESS(STM)信号通路在干细胞维持中也发挥着积极的作用.在此主要综述了模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)茎尖干细胞维持分子机制的最新研究进展.

茎尖干细胞;WUS-CLV;细胞分裂素;小RNAs;表观遗传;STM

植物地上部分的胚后发育主要依赖于茎尖分生组织(shoot apical meristem,SAM).SAM通常是指最小叶原基上方的茎端区域(图1(a)),相当于经典植物学中的初生分生组织或茎顶端分生组织狭义概念所涵盖的内容.在以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为代表的双子叶植物中,SAM的作用是形成叶片和花,维持茎干的生长和保持自身的位置、大小及结构.另外,在树木的地上部分发育中,维管的环状形成层(ringshaped cambium)和软木形成层(phellogen cambium)分生组织对于茎的长粗具有重要作用.

SAM在细胞水平可分为顶端中央区域(central zone,CZ)、侧旁围绕CZ分布的外围区域(peripheral zone,PZ)和CZ基部的肋状区域(rib zone,RZ)[1-2],如图1(b)所示.植物茎尖干细胞位于CZ,通过缓慢的细胞分裂实现自我更新并维持在未分化状态,它们是新器官和组织发育的来源;PZ细胞分裂较快,进而分化成不同的器官原基;RZ细胞同PZ细胞一样分裂也较快,它保证了植物能够向上生长[1-2].在CZ下方有一团细胞称为组织中心区域(organizing center,OC),这里的细胞决定了其上方干细胞的命运和数量,对于干细胞的维持起着决定性作用.

根据CZ干细胞的克隆特性又可将SAM分成三层,即外层的L1,表皮下的L2和内部的L3[3](图1 (a)).干细胞一次分裂后产生的两个子细胞一个留在原位置成为新的干细胞,而另一个移向其他区域成为待分化的细胞,这种截然不同的命运是由其所在位置决定的[4-5].在分裂形式上,L1与L2的干细胞都进行垂周分裂,即新形成的细胞壁垂直于外表面,这样在每一层面上干细胞分裂后产生的两个子细胞中一个保持在原位置,另一个则移向PZ,进而保证了L1与L2分别属于不同的层次.L3细胞既可进行垂周分裂也可以平周分裂,由此位于顶端的子细胞留在原位置而另一个子细胞移向PZ或RZ.由于干细胞具有多能性,所以每一层茎尖干细胞的子细胞都可以发展成为这一层中的各种细胞类型.最终,L1细胞发育成为表皮组织,L2发育成为皮下组织,而L3发育成为髓和维管组织[3,6-9].

在植物生长发育过程中,SAM的干细胞处于动态平衡中,其分裂产生的细胞一方面进行自我更新,另一方面为侧翼器官原基的发育提供源泉.动态平衡的维持来自于干细胞周围不同信号因子之间的协同调控作用(图1(b)),干细胞所处的这种环境称为干细胞微环境.在干细胞微环境中核心信号通路是在OC表达的WUSCHEL(WUS)基因与干细胞基因CLAVATA(CLV)之间形成的负反馈调节环,即WUS基因表达后决定了其顶部细胞发育成干细胞并在此处转录激活CLV3基因的表达,CLV3基因又会反过来抑制WUS基因的表达,由此形成了“走走停停”的调控模式.其他信号因子如细胞分裂素(cytokinin,CK)、可以移动的小RNAs和表观遗传调控因子,最终都作用于这条信号通路来实现对干细胞动态平衡的调节.与WUS-CLV相平行的SHOOTMERISTEMLESS(STM)信号通路可以抑制干细胞的分化并促进PZ细胞在形成器官原基前的分裂.

1 WUS-CLV负反馈调节环

WUS基因编码植物中特有的同源异型转录因子(transcription factor,TF),它是WUSCHEL-related homeobox(WOX)基因家族的基础成员[10].WUS的表达起始于胚胎的16细胞时期,表达范围位于胚胎顶部内层的4个细胞,并且随着顶部细胞不断地进行纵向与横向分裂,WUS的表达区域逐渐下移到达SAM的中央.苗期时WUS在OC表达.花序分生组织(inflorescence meristem,IM)中WUS表达区域同苗期一样,然而在花分生组织(floral meristem,FM)中WUS的表达会上移到L3,说明SAM与FM的组织形式存在差异[11].wus突变体在苗期时没有类似于野生型穹顶状的SAM,并且在干细胞区域出现一定程度已经分化的细胞,在IM中也表现出同样的缺陷,说明WUS可以阻止干细胞的分化[11-12].在过表达WUS时不仅导致SAM增大,还可以诱导异位干细胞产生,表明WUS可以决定干细胞的属性[13-15].

CLV3基因编码具有96个氨基酸的蛋白,其属于32个CLV3/EMBRYO SURROUNDING REGION (CLE)蛋白家族的一员.它在N端具有18个氨基酸长度的信号肽而C端含有一个同其他CLE家族蛋白相似的14个氨基酸长度的CLE保守结构域,此结构域在翻译后被加工成有活性的小分子多肽CLEp(CLE peptide)[16-18].许多其他CLE基因在CLV3启动子的启动表达下可以恢复clv3突变体的表型,这表明CLV3与这些CLE基因存在功能上的冗余[19].在植物体中CLV3前体蛋白分别在Arg70与His81或者Arg70与His82位点处通过细胞外水解作用而剪切成为具有12或13个氨基酸长度的CLEp[20-21].在CLEp的Pro7位点还需要进一步发生羟基化和3个树胶醛糖化修饰使其成为有功能活性的肽段[21].CLV3的表达模式在SAM顶端成楔形结构,此区域大体与干细胞一致.因为在L3表达CLV3的细胞数量明显少于L1,所以在每层干细胞数量相当时,CLV3的表达区域并不完全等同于干细胞所在区域.clv3突变体的SAM和FM明显增大,并且与野生型相比产生更多器官[22],这说明CLV3对干细胞的维持起负调控作用.

研究发现在clv3中SAM增大是由于WUS表达区域扩大所致[15];相反地,在过表达CLV3时又抑制WUS的表达,并表现出wus的表型[23-24].另一方面,在wus中CLV3表达消失;而在过表达WUS时, CLV3表达区域扩散[13,15].由此建立了一个反馈抑制通路,即WUS在OC表达后决定并促进上方相邻细胞成为干细胞,干细胞表达CLV3,而后CLV3又抑制WUS表达使其保持在适当水平并稳定在OC,通过这种方式维持干细胞的动态平衡(图1(b)).

建立在突变体研究基础上的WUS-CLV反馈调节途径只展示了基因突变后所导致的最终结果,并不能清楚地阐释在干细胞动态平衡的维持中CLV3和WUS基因的具体作用机制.由此,Reddy等[25]和Yadav等[26]分别在2005年和2010年报道了诱导性沉默或过表达基因后茎尖瞬时变化的结果.研究发现CLV3的功能是防止紧邻CZ的PZ干细胞的子细胞脱分化重新形成干细胞,并且通过抑制PZ细胞的有丝分裂速率来维持SAM的大小[25];而WUS在CZ过表达时能促进整个PZ细胞转化成为干细胞,提高PZ细胞的有丝分裂速率,并控制PZ细胞参与分化和保持不分化的比例[26].由此,CLV3和WUS采用对立的机制在PZ与CZ细胞的相互转化、PZ细胞的分裂速率和PZ细胞的分化比例这3个层面维持SAM的动态平衡.随后,这其中部分工作得到了分子水平的阐释.Yadav等[27]证明大部分受WUS激活的基因在SAM的CZ表达,而受WUS抑制的大部分基因在PZ表达,且受WUS抑制的基因中很多是促进细胞分化的转录因子,其中已经报道的有37个,包括在叶的极性建立及分化中起作用的基因KANADI1、KANADI2、ASYMMETRIC LEAVES 2(AS2)和YABBY3,以及在PZ与RZ表达而有可能对细胞命运特化及IM干细胞分化起作用的K NAT1/BREVIPEDICELLUS (BP)、BLH5、BHLH093和ANAC083.WUS对促进分化的转录因子的抑制作用是其参与维持SAM稳定的一个重要方面.与之类似,Busch等[28]通过用不同遗传背景下的植物(wus和诱导性过表达WUS的转基因植株)进行表达谱分析,发现受WUS响应的基因有667个之多;随后在全基因组水平进行WUS的ChIP-chip实验,发现WUS可以直接结合在118个靶基因的启动子上,而且这种结合至少需要每个启动子上2个不同的元件参与,这些靶基因主要在CK、生长素(auxin)、茉莉酸(jasmonate)几种激素信号途径以及发育过程和代谢过程中发挥作用.

图1　茎尖分生组织及其维持的分子信号通路Fig.1 The shoot apical meristem and its maintenancepathway

在WUS对于干细胞的决定方向上,Yadav等[29]发现WUS蛋白可以移动到干细胞区域并激活CLV3的表达.在他们的研究中,IM中的eGFP-WUS融合蛋白(p WUS:eGFP-WUS)可以扩散至L1,而其m RNA仍然在OC,并且p WUS:eGFP-WUS可以恢复wus;相比之下,2×eGFP-WUS(增加蛋白的大小)或者NLS-eGFP-WUS蛋白(将融合蛋白进行核定位)在IM中的移动性和对wus的恢复能力则明显减弱,证明WUS具有移动性并且这种移动对SAM的维持发挥重要作用;随后又证明了WUS移动到CZ后会直接与CLV3启动子结合进而启动其表达[29-30].值得注意的是,WUS蛋白在FM中的移动性比较复杂, eGFP-WUS、2×eGFP-WUS和NLS-eGFP-WUS蛋白在FM发育早期都能在L1检测到,而在后期2× eGFP-WUS和NLS-eGFP-WUS则定位于OC[29].对于eGFP-WUS有可能产生的偏差,Daum等[31]用免疫组织化学的方法进一步确认了内源WUS蛋白的移动性,并进而证明了WUS这种细胞与细胞间的移动需要借助于起细胞沟通桥梁作用的胞间连丝(plasmodesmata,PD),在干细胞区域诱导性表达胼胝质合成酶时(胼胝质合成酶可以在PD周围堆积胼胝质使细胞壁加厚从而减小PD的直径而减弱其功能),受WUS启动子表达的WUS-linker-GFP融合蛋白不能移动到L1并且干细胞出现分化.WUS蛋白的同源异型结构域(homeodomain,HD)对其移动有促进作用,而HD与WUS-Box功能域之间的非保守区域对其移动起限制作用,这种不同区域间的相互作用保证WUS向上呈楔形移动而不是移向SAM外围区域进而诱导形成干细胞;此外还发现非保守区域介导WUS形成二聚体,推测WUS的二聚化可能对其移动性有影响[31].已有研究表明STM蛋白(详见后文STM信号途径)依赖于PD的移动需要分子伴侣CCT8的参与[32],然而在cct8突变体中WUS的移动并未受到影响[31],说明这些关键蛋白的移动机制并不具有普遍性.

CLV3对WUS的反馈调节过程中,成熟的CLV3p从干细胞区域向下方移动,被多种富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat,LRR)的受体接收从而抑制OC细胞中WUS的表达[33](图1(b)).在这些受体中第1种就是CLV1.CLV1编码LRR受体激酶,其主要在RZ表达,也会出现在OC和CZ的L3[34],已有研究证明CLV3p可以直接结合在CLV1的LRR结构域上[35],但clv1的表型要比clv3弱很多,造成这种现象的原因是BARELY ANY MERISTEM 1,2和3 (BAM1,2和3)基因的参与.BAM基因编码具有LRR功能结构域的受体激酶,然而其功能与CLV1刚好相反,bam1 bam2 bam3三突变体中SAM明显变小[36-37].正常情况下,由于CLV1基因在RZ的表达从而抑制BAM基因在此区域的表达;当CLV1基因突变时,BAM恢复在RZ的表达也进而抑制SAM的扩增,由此可以解释单纯clv1突变体表型较弱,而clv1 bam1 bam2 bam3四突变体表型显著增强的原因[38].第2种受体是CLV2-CORYNE(CRN)复合物受体. CLV2也是类似LRR受体的跨膜蛋白但其不含细胞内的激酶功能域;CRN具有类似于CLV1的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶活性但缺少细胞外LRR功能域[39-40],其与CLV2形成异源二聚体独立于CLV1作为CLV3p的另一受体[41].然而Nimchuk等[42]发现CRN不能自我磷酸化,它的功能发挥类似于动物中的假激酶(pseudokinases),并不依靠激酶活性,而是起脚手架的作用.第3种受体是RECEPTOR-LIKE PROTEIN KINASE 2(RPK2).rpk2的表型相较于clv1与clv2要弱,但也会导致干细胞扩散,并且clv1 clv2 rpk2三突变体的表型更接近于clv3,说明RPK2在CLV3主导的信号通路中发挥次要作用但又独立于CLV1与CLV2-CRN受体[43].

LRR受体都是膜蛋白,在其接受到来自干细胞分泌的配体CLV3p后如何将此信号传导进入细胞内部一直以来并不清楚.最近这一作用机制在玉米(zea mays)的相关研究中获得了进展[44]:玉米COMPACT PLANT 2(CT2)基因编码异源三聚体GTP结合蛋白的α亚单位,它可以直接结合玉米的跨膜蛋白受体FASCIATED EAR(FEA,CLV2的同源蛋白).异源三聚体GTP结合蛋白是与之相联系的膜蛋白进行信号传导的分子开关,它通常是受7个跨膜蛋白接收配体后激活[45],而在玉米的研究中一个这样的跨膜受体FEA就足以激活.玉米ct2突变体的SAM表型同拟南芥中clv突变体类似,用CLV3p处理野生型时会抑制SAM的生长而处理ct2则不会.尽管如此,信号由胞外传递到胞内后最终又是如何抑制WUS表达的分子机制尚待研究.

CLV3p对WUS的抑制作用存在一个平衡,因为过量的CLV3p或者仅在L1过表达CLV3都会完全抑制WUS的表达,出现wus的表型[23-24].现在就这个问题存在2种对立的观点:1)CLV1受体通过直接结合屏蔽CLV3p使其不能进入WUS的表达区域OC.这个模型建立在对CLV3-GFP融合蛋白的观察发现其主要向侧边移动,而很少向正下方OC移动[24],并且在这个过程中CLV2会辅助CLV1以提高其稳定性,随后的研究证实CLV3p可以直接结合CLV1也支持这一模型[21,35].2)CLV1的存在依赖于CLV3p的剂量性调控.在这种模型中,CLV1在clv3背景下于细胞质膜中得到积累,当CLV3p存在时,CLV1被转运至溶酶体中被降解,CLV3p的数量决定了CLV1的量,进而决定了信号的传导[46],据此可以解释为什么SAM承受CLV3表达水平10倍以上的变化时并不引起表型的改变和WUS表达水平先降低而后又得到恢复[47].此外,WUS本身也可以通过抑制CLV1的表达进而降低CLV3p的抑制效应进行自救,通过直接结合在CLV1启动子上距离转录起始位点600 bp的位置而抑制CLV1的表达[28].再者,CLV信号通路下游存在POLTERGEIST(POL)和POLTERGEIST-LIKE1 (PLL1)基因,它们可以促进WUS的转录,而其又受CLV信号通路抑制[48-49].POL和PLL1编码2C型蛋白磷酸酶,它们在功能上冗余,可以通过乙酰化而定位于细胞质膜的内表面,而CLV3的几种受体蛋白也都定位于细胞质膜上,它们之间或许存在着联系进而调控WUS-CLV信号通路的动态平衡[50].

2 CK信号通路

在SAM中合成的CK并没有活性,它需要CK激活酶的激活.在水稻中LONGLYGUY(LOG)[51]编码CK激活酶,其作用于CK合成过程的最后一步,将未激活的核苷转变成有生物活性的碱基(图1(b)).LOG在SAM的最顶端2～3层细胞表达,包含干细胞区域.水稻log在营养生长期间SAM体积减小,在生殖生长过程中产生较少的分支并且形成不完整的花,发育较早终止[51].在拟南芥中有9个LOG同源基因,其中LOG7对SAM 的维持贡献最大[52],另外Chickarmane等[53]发现LOG4在SAM的L1表达, LOG在SAM顶端表达,这样就使有活性的CK从干细胞区域向下扩散至RZ并在此区间形成一个浓度梯度,这对于OC中干细胞的维持及其保持未分化状态有重要作用.

在OC中,WUS的活性与CK的功能有着紧密的联系.通过观察与GFP相融合的CK感应因子TCP的表达,发现OC是SAM中CK响应区域.CK受体ARABIDOPSIS HISTIDINE KINASE 4(AHK4)/ WOODENLEG的表达覆盖整个OC,在这里AHK4诱导WUS的表达并且抑制WUS的拮抗基因CLV1的表达[54].WUS又可以直接抑制细胞内的CK负调控因子ARR7和ARR15的表达.降低ARR7和ARR15的表达水平会使SAM增大,而过表达ARR7时呈现wus的表型[39].同时,受生长素激活的AUXIN RESPONSE FACTOR 5/MONOPTEROUS(ARF5/MP)转录因子也会直接抑制ARR7和ARR15的表达[55].由此在OC形成高水平的CK浓度,进而诱导并稳固了WUS的表达,WUS又抑制ARR7和ARR15的表达,于是构建成一个正反馈调控途径(图1(b)).另外,在RZ还存在CK降解酶CYTOKININ OXIDASES 3(CKX3)来平衡CK的水平[56-57].总之,WUS介导了细胞内CK的信号传导途径,OC细胞在SAM中接收并传导CK信号又进一步增强了WUS的表达.

3 可移动的小RNAs

HOMEODOMAIN-LEUCINE ZIPPERⅢ(HDZIPⅢ)家族基因的部分功能是调控胚胎顶部模式发生和胚胎发育时期SAM的形成[58].在拟南芥中存在5个HD-ZIPⅢ基因,分别是PHABULOSA (PHB)[59]、PHAVOLUTA(PHV)[59]、REVOLUTA (REC)、ARABIDOPSIS HOMEOBOX GENE 8 (ATHB8)和ATHB15/CORONA(CNA)[60]. HD-ZIPⅢ基因的突变会导致SAM终止[61-62],而提高其表达水平又可以导致SAM增大或者SAM异位再生[59].尽管现在并不清楚HD-ZIPⅢ基因家族在调控SAM方面的分子机制,但知道HD-ZIPⅢ基因本身受多种非编码小RNAs的调控[63],在SAM中主要是micro RNA165/166的靶基因[64].

MicroRNA165/166对HD-ZIPⅢ基因的攻击受ARGONAUTE1(AGO1)与ZWILLE(ZLL)/PINHEAD(PNH)/AGO10[65-67]的精确调控.ARGONAUTE蛋白是RNA沉默复合体中的关键因子. AGO1与AGO10蛋白序列相似度很高,其中包括2个重要的功能区域PAZ与MID,而且PAZ功能域可以在2个蛋白间互换,但是它们的功能却是截然相反的[68].microRNA165/166在AGO1的介导下降解SAM中HD-ZIPⅢ基因的mRNA,使其表达水平下降;而micro RNA165/166与AGO10特异性结合后AGO10不会发挥其催化降解活性;生化实验证明AGO10与microRNA165/166的结合能力强于AGO1,所以AGO10的功能就是沉默体内micro RNA165/166,使其不能与AGO1结合,从而稳固HD-ZIPⅢ基因的表达[69].因此microRNA165/166信号因子类似于一种分子开关,其通过“偏向”不同的两侧而起到截然相反的效果(图1(b)).在zll/pnh/ ago10突变体中表现出胚胎发育后期SAM不能维持的表型,分子水平上microRNA165/166上升,HDZIPⅢ基因的转录本下降;而在SAM中增加HDZIPⅢ基因的表达水平或者降低microRNA165/166的水平时又可以部分恢复zll/pnh/ago10的异常表型[64].

拟南芥中microRNA165/166家族基因中有9个成员,他们中的5个在胚胎中的表达模式非常保守,都在胚胎基部的外围区域表达[70].MicroRNA165/166在胚胎中具有移动性,通过移动降解分布于整个胚胎中的PHB m RNA最终使其只在胚胎中央的顶部表达[64].AGO10基因在围绕SAM的原形成层处表达,可能正是因为AGO10的这种表达模式为SAM提供了一层保护屏障,通过沉默micro RNA165/166使SAM原基免受干扰;深入研究发现仅在OC正下方的维管组织区域表达AGO10就可以恢复其突变体的表型,说明这个区域对于SAM的维持具有特殊的作用[69,71].

与microRNA165/166表达模式基本上相反的是microRNA394,在胚胎时期它仅在SAM的L1特异性表达.MicroRNA394也具有移动性,通过移向SAM内部从而使干细胞维持在未分化状态且对CLV3在CZ表达发挥重要作用(图1(b)).MicroRNA394的靶基因是LEAF CURLING RESPONSIVENESS (LCR),其编码的F-Box蛋白是干细胞抑制因子,可以介导生长素信号通路并促进叶的发育[72].尽管microRNA394在L1表达,但L1并不需要它的作用,因此Knauer等[73]认为microRNA394的这种表达规律和作用方式正是干细胞在经过细胞分裂和生长而始终处于SAM的原因,其作用类似于LOG.

4 表观遗传作用

表观遗传现象是指在DNA序列没有改变的情况下,基因功能出现可逆、可遗传的改变.在植物的生长发育过程中,细胞核基因组中等位基因尤其是有时空表达特性的基因会受某种因素影响而被选择性地开启或者关闭,从而引起表观遗传现象.这些因素主要包括:核小体组装、ATP依赖型的染色质重塑、组蛋白修饰及DNA甲基化[74].它们对SAM的维持作用最主要是通过对WUS基因的转录调控来实现的.

在参与核小体的组装中有2个进化上保守的蛋白CHROMATIN ASSEMBLY FACTOR 1(CAF-1)和NUCLEOSOME ASSEMBLY PROTEIN 1(NAP1),它们分别负责将组蛋白H3/H4亚基和H2A/H2B亚基包装入核小体[74].FASCIATA 1(FAS1)和FAS2编码CAF-1蛋白复合体的2个核心亚基,它们在SAM及叶原基中表达,在fas1与fas2中SAM变得扁平肥大, WUS的表达区域明显扩散[75],说明CAF-1可以抑制WUS的表达.BRUSHY1(BRU1)/MGOUN3(MGO3)/ TONSOKU(TSK)编码的蛋白对DNA复制或者修复后的结构起到稳定作用,其突变后的表型同fas1和fas2非常相近[76-78].

在植物生长发育过程中,组蛋白与DNA之间相互作用会发生重新调整进而改变染色质的结构与活性,从而调节基因的表达,即为染色质重塑.ATP依赖型的染色质重塑蛋白复合体在这一过程中具有重要作用,这些复合体的核心成员是 ATP酶[74]. SPLAYED(SYD)编码一种SWI/SNF型ATP酶,它可以直接结合于WUS的启动子上(-435～-70 bp),并控制WUS的表达水平.在syd中,WUS的表达水平和SAM的大小全都降低[79-80].BRCA1-associated RING domain 1(BARD1)也可以抑制WUS的表达,并且可以结合在SYD上,BARD1可能是通过抑制SYD的活性进而抑制WUS的表达. BARD1蛋白具有BRCA1 C-terminal(BRCT)与RING 2个前后相连的功能域,其可以直接结合于WUS的启动子上(-260～-206 bp).在bard1-3中, WUS m RNA表达上调238倍,其表达区域扩散至L1～L3;而在过表达BARD1时又表现出wus的表型[79,81].

组蛋白修饰的方式有多种,包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化,在现有的研究中参与SAM调控的主要是组蛋白赖氨酸甲基化修饰(histone lysine methylation modification).组蛋白H3的N端4个赖氨酸修饰位点对于基因的表达至关重要,它们分别是H3K4、H3K9、H3K27和H3K36位点,而在赖氨酸上有3个可以被甲基化修饰的化学键,因此又可以分为一、二和三甲基化修饰(me1,me2,me3).一般认为H3K4和H3K36的甲基化修饰促进基因表达,而H3K9和H3K27的甲基化修饰则导致异染色质化和基因沉默.赖氨酸甲基化修饰需要甲基转移酶(lysine methyltransferase,KMT)的参与,它通常含有一个约130个氨基酸组成的SET结构域[74](甲基转移的催化中心).拟南芥中有47个编码SET结构域的蛋白,而参与对SAM维持的主要有Trithorax group(Trx G)与Polycomb group(PcG)两类.Trx G负责H3K4me3修饰,能够激活基因的表达;而PcG的功能则与之相反,通过直接结合于DNA的可识别区域进而诱导H3K27me3修饰,使基因处于沉默状态[79].

5 STM信号途径

在SAM的维持中存在着与WUS-CLV反馈调节通路相平行的另一条信号通路,而这条信号通路中核心成员是STM[14,82-85].STM编码同源异型结构域转录因子,属于KNOTTED1-like homeobox(KNOX)基因家族成员[86].STM在玉米中的直系同源基因是KNOTTED1(KN1),KN1是KNOX基因家族的基础成员也是在植物中发现的第一个能够调控干细胞的基因[87].stm-1突变体在胚胎发育时期即没有SAM形成,在胚胎后发育时期同样没有SAM并且子叶叶柄基部融合,大部分stm不会形成其他器官即老化,偶尔能够发育的植株叶片基部也会部分融合,在花发育过程中总是以未成熟的异位器官原基融合在一起的形式终止[84].STM在胚胎发育球形期开始表达,并且在胚后发育的SAM和FM中未分化的细胞中表达,在分生组织邻近的器官或者花器官原基中没有表达[86].通过突变体表型和在生长过程中的表达变化说明STM有两大功能:其一为防止干细胞分化,其二为促进干细胞的子细胞在形成器官前的增殖[14,84,86,88].

STM和WUS的缺失都可以引起SAM的终止,但其机制有所不同.在stm中没有可以识别的SAM[84],而在wus中尽管SAM终止,但其仍然存在并且变得扁平肥大,说明CZ细胞仍然存在只是没有功能[12].随后的研究表明STM与WUS的功能是相互独立的.分别异位表达WUS与STM能够诱导不同的下游基因表达.WUS的功能主要是特化CZ的细胞成为干细胞,而STM的功能是抑制干细胞的分化和促进干细胞子细胞的增殖[14].

像WUS一样,STM也可以在SAM中借助于PD进行移动,并且对于STM的可移动性研究要比WUS更早更深入.早在1994年就发现KN1蛋白的表达范围超出其m RNA的表达区域[89],随后通过显微注射的方式证实了KN1借助于PD移动,其可以增大PD的排阻极限(size exclusion limit,SEL),还可以介导KN1正义链m RNA借助于PD进行移动[90].GFPKN1可以在叶片与SAM中移动[91],并且这种移动有其特殊调控方式.在叶片中GFP-KN1可以从叶肉细胞向表皮细胞移动,但反方向不可以;而在SAM中, GFP-KN1与GFP-STM可以从L1向内层移动,并且在L1特异性表达KN1可以部分恢复stm-11(强表型突变体)[92].KNOX家族的异型结构域对于其蛋白与mRNA的移动是必须的[93].最近的研究发现KN1与STM的移动还需要伴侣蛋白CCT8的参与(细胞质内二型分子伴侣复合物的亚单位),在敲除CCT8基因后表现出stm突变体的强表型.CCT8的另一个作用就是在STM移向的目的细胞中可以将STM重新折叠成有活性的蛋白[32].现在并不清楚STM或者KN1蛋白移动的意义,有可能是为在SAM中形成一定的蛋白浓度梯度.

STM通过在SAM的CZ抑制器官形成基因AS1和AS2的表达进而阻止干细胞的分化[94].AS1是金鱼草(Antirrhinum majus L.)中PHAN和玉米中ROUGH SHEAT H2(RS2)的同源基因,它编码一个具有MYB功能域的转录因子,而AS2编码具有LATERAL ORGEN BOUNDARY(LOB)功能域的蛋白[95-97].在每个物种中,这些基因都参与侧生器官的起始.STM及其他KNOX家族蛋白(KNAT1/BP, KNAT2和KNAT6)抑制AS1、AS2在SAM中心区域的表达,而AS1、AS2反过来也会抑制K NOX基因在发育中的器官原基处的表达[95-96,98-100].STM的表达模式也反映了这种调控关系,其在SAM中的表达贯穿整个CZ,而在器官原基发育位置却有明显的下降[95].AS1、AS2与组蛋白分子伴侣HIRA形成转录抑制复合体进而结合于KNOX家族基因的顺式作用元件上来抑制K NOX的转录[101-102].

另一方面STM可以通过调节CK与赤霉素(gibberellin,GA)信号通路来维持SAM.CK可以通过激活细胞周期蛋白D(cyclin D)的表达进而促进细胞分裂[103],其本身对SAM的维持起着重要作用;而GAs包含一大类二萜类化合物,它们可以促进器官增大与植物形态发生[104].

STM在SAM中直接激活CK合成酶基因ISOPENTENYL TRANSFERASE 7(IPT7)与CK响应因子ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR 5 (ARR5)的表达,当施用外源CK或者用STM启动子表达IPT7都可以部分恢复stm的表型,而在过表达STM时则可导致体内CK水平上升和诱导异位分生组织形成[105-106].可见STM对IPT7的激活在SAM维持中起关键作用(图1(b)).在过表达其他KNOX家族基因如KNAT1/BP时也会导致产生高水平的CK,这说明其他KNOX基因家族成员有同STM类似的功能[105,107].

在对GA水平的调控上,KNOX家族转录因子Nicotiana tabacum homeobox 15(NTH15)在CZ直接结合在GA合成酶基因GA 20-oxidase(在GA合成过程的倒数第二步发挥作用)的第一个内含子上抑制其表达[108-109],从而阻断了GA的生物合成,并且在表达模式上GA 20-oxidase与STM基本一致[110].然而仅通过这种方式还是不够的,因为在叶原基合成的GA可以扩散到SAM中.STM通过激活GA分解代谢基因GA 2-oxidase的表达使流入SAM的GA失活,GA 2-oxidase在SAM基部和发育中的叶原基表达除受STM调控外,CK信号对于其激活也是必要的[105].由此通过KNOX家族蛋白在SAM中建立起高水平CK活性和低水平GA活性的激素环境,这对于SAM的维持起着非常重要的作用.

6 小结与展望

近20年来对于植物SAM维持分子机制的研究取得了卓越的成绩,发现了SAM维持中最核心的信号调节通路,并以此为基础搭建了分子调控的信号网络.越来越多的生物学因素被发现参与SAM的维持,主要包括植物激素,小RNAs和表观遗传作用,也由此说明SAM的调控机制极其复杂.加之SAM处在一个高度联系并且非常稳定的调控网络之中,在时间与空间上都为研究带来诸多不便.到目前为止在WUSCLV信号途径中还不清楚WUS决定干细胞和CLV途径抑制WUS的具体作用机制.通过激光共聚焦技术实时观察SAM的变化并经过计算机建模是近几年发展起来的解决这一科研难题的方法.

早在2007年通过在根尖中收集不同细胞类型进行了根尖干细胞的基因表达谱分析[111-112],该方法相较于对整个根尖分生组织的转录本进行检测具有更高的灵敏度,可以检测到一些表达丰度低或者只在根尖分生组织表达的基因.2009年Yadav等[56]对SAM也开展了同样的工作,并且在2014年又对这种不同细胞类型的取样进行了优化,细胞分类更加细化[113].通过表达谱分析发现有大量在SAM特异性表达的基因,然而这些基因的功能现在尚不清楚;另外受WUS激活与抑制又或者可以直接结合的基因也有很多,它们是否参与对SAM的维持作用也不清楚.因此SAM的分子机制研究工作任重而道远.

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Research Progresses of the Regulatory Mechanism of the Shoot Apical Stem Cell in Arabidopsis

CUI Yuchao,CHEN Liang*

(Xiamen Key Laboratory for Plant Genetics,School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China)

The shoot apical stem cell is a pool of pluripotent cell in the apex of the plant,which is the source of the whole parts above the ground.The stem cell divides to produce two daughter cells.One can renew itself,and the other can form the organ promordia for proliferation.At last the stem cell stablizes in homeostasis,which can maintain plant development even up to a thousand years. Modern molecular biology and genetics have indicated that the homeostasis is regulated exactly by various factors from stem cell niche.The key pathway among the network is the negative feedback loop between the WUSCHEL(WUS)gene and the CLAVATA (CLV)gene.Other biological factors,such as cytokinin,the moved small RNAs and the epigenetics effects,play a role on this loop eventually.Besides,the SHOOTMERISTEMLESS(STM)signaling pathway,which is parallel to the WUS-CLV loop,plays a positive role in stem cell maintenance.This article mainly reviewed the latest research progresses on the molecular mechanism of stem cell maintenance in model plant Arabidopsis.

stem cell maintenance;WUS-CLV;cytokinin;small RNAs;epigenetics;STM

Q 356.1

A

0438-0479(2016)06-0781-12

10.6043/j.issn.0438-0479.201604104

2016-04-13 录用日期:2016-06-20

国家重点研发计划项目(2016YFD0100903);国家自然科学基金(31560297)

chenlg@xmu.edu.cn

崔玉超,陈亮.拟南芥茎尖干细胞调控机制的研究进展[J].厦门大学学报(自然科学版),2016,55(6):781-792.

CUI Y C,CHEN L.Research progresses of the regulatory mechanism of the shoot apical stem cell in Arabidopsis[J]. Journal of Xiamen University(Natural Science),2016,55(6):781-792.(in Chinese)