ANGPTL4免疫脂质体对急性肺损伤小鼠的治疗作用

赵咏梅 王瑞 李新宇 贺志高 桂俊豪张东辉 王晓燕 张峰 张羽 姜鹏



·论著·

ANGPTL4免疫脂质体对急性肺损伤小鼠的治疗作用

赵咏梅1王瑞2李新宇3贺志高3桂俊豪2张东辉4王晓燕3张峰5张羽5姜鹏5

目的探讨ANGPTL4免疫脂质体对转染脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱发的急性肺损伤(acute lung injury, ALI)小鼠，肺损伤的影响。方法采用逆相蒸发法制备ANGPTL4基因表达质粒与抗CD31抗体偶联的免疫脂质体；LPS诱发急性肺损伤小鼠模型；观察经ANGPTL4免疫脂质体转染的急性肺损伤小鼠的肺部炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)水平和中性粒细胞活化标志物髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)表达的变化，以及小鼠肺组织病理变化和肺血管通透性的改化。结果ANGPTL4免疫脂质体可以有效增加小鼠肺内ANGPTL4的表达；进而降低ALI小鼠肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-6水平和MPO的表达；降低ALI小鼠肺组织湿干比和肺泡灌洗液蛋白浓度，减轻肺组织病变程度。结论ANGPTL4免疫脂质体能有效减轻 LPS 诱导的ALI小鼠的肺部炎症损伤反应。

ANGPTL4； 免疫脂质体； 急性肺损伤； 肿瘤坏死因子； 白细胞介素-6； 髓过氧化物酶

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是由各种肺内外因素所致的以急性呼吸窘迫、非心源性肺水肿和持续过度的炎症反应为特点的临床综合征[1-2]，是爆发性流感、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)、重症肺炎等疾病死亡的主要原因。ANGPTL4基因是ANGPTLs 基因家族的一个成员，在调节血管发生、脂类代谢、糖类代谢和胰岛素敏感性等具有重要作用[3-5]。研究表明, ANGPTL4能显著抑制血管内皮细胞的增殖、趋化性和血管形成，并且显著抑制体内血管内皮生长因子诱导的血管生成和血管渗漏[6-7]。

本研究通过制备ANGPTL4基因表达质粒与抗CD31(血管内皮细胞特异性抗原)抗体偶联的免疫脂质体，并转染脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱发的ALI小鼠，观察ANGPTL4在急性肺损伤小鼠肺微血管内皮细胞上的表达变化，评估ANGPTL4对LPS诱导的肺组织损伤的影响，旨在探讨其作用和可能机制，为ALI防治提供理论依据和实验基础。

材料和方法

一、 实验材料

健康BALB/c雄性小鼠(8周龄，体重20～25 g，由新疆实验动物研究中心提供)40只；pcDNA3.1-ANGPTL4重组质粒由本室制备并保存；CD31抗体、ANGPTL4抗体购自美国BD公司； LPS购自美国Sigma公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素6((interleukin-6, IL-6)酶联免疫(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)检测试剂盒购自广州欣博盛公司；卵磷脂、胆固酵、DSPE-PEG2000购自Avanti公司；薄膜挤出器购自Avestin公司；Sepharose CL-4B购自Phamacis公司。

二、实验方法

1. 免疫脂质体与抗体的偶联：制备方法参照相关文献[8-10]。采用逆相蒸发法，将卵磷脂、胆固酵、DSPE-PEG2000按比例溶于氯仿液中形成油相，旋转蒸发仪除去有机溶剂，水浴超声波仪处理5 min，加入质粒DNA在42 ℃水浴和干冰中反复冻融，并连续通过100 nm薄膜挤出器，未包裹入脂质体的质粒用DNaseI和exonucleaseⅢ 37 ℃作用1 h，EDTA终止反应。琼脂糖CL-4B柱分离包裹质粒DNA的脂质体和被核酸酶降解的DNA，琼脂糖凝胶电泳检测。CD31单克隆抗体经修饰硫化后与包裹质粒DNA的脂质体室温下轻摇连接过夜，再次用琼脂糖CL-4B柱分离未连接的抗体和免疫脂质体，置4 ℃冰箱备用。

2. LPS诱发ALI小鼠模型及实验分组: 小鼠实验前禁食8 h，自由饮水，随机分为四组，每组10只：①生理盐水对照组：腹腔注射生理盐水；②ALI组：以氯胺酮(150 μg/g)腹腔内注射麻醉小鼠，麻醉后环甲膜穿刺于气管内滴入LPS(3 μg/g)；③干预对照组：在LPS注射前3 d经鼻滴入给予CD31抗体-空载体免疫脂质体转染；④干预组：在LPS注射前3 d经鼻滴入给予ANGPTL4免疫脂质体转染。

3. ANGPTL4免疫脂质体对LPS诱导的肺组织损伤影响的观察: 分别于气管内滴入LPS后6 h眦静脉放血处死小鼠，收集血清用于TNF-α、IL-6的ELISA检测；结扎右肺，左肺行肺泡灌洗，釆用BCA法测定肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白含量。4%多聚甲醛固定右肺上叶，常规石蜡包埋、切片，用于HE染色和免疫组织化学检测。右肺下叶行肺干湿比测定衡量肺水肿情况。右肺其它部分放于-70 ℃保存，提取RNA和蛋白，采用荧光定量反转录PCR和Western-blot法检测ANGPTL4和MPO的表达。相关引物序列(其中ALB和FOXP2作为内参基因)，见表1。

表1 相关引物序列

三、统计学方法

结 果

一、ANGPTL4免疫脂质体对小鼠肺组织 ANGPTL4表达的影响

我们采用荧光定量反转录PCR(RT-PCR)和Western blot 方法检测了小鼠肺内 ANGPTL4的表达水平，结果显示，与生理盐水对照组相比，LPS组小鼠肺内ANGPTL4的表达显著增加(P<0.05)；与干预对照组相比，干预组小鼠肺内ANGPTL4的表达显著增加(P<0.05)；而LPS组和干预对照组小鼠肺内ANGPTL4的表达则无显著性差异(P>0.05)，见图 1。

图1 ANGPTL4免疫脂质体对小鼠肺组织 ANGPTL4表达的影响；注：A：RT-PCR 检测各处理组小鼠肺组织中 ANGPTL4基因的表达；B：Western blot检测各处理组小鼠肺组织中 ANGPTL4蛋白的表达

二、肺部炎症因子TNF-α、IL-6水平和中性粒细胞活化标志物MPO表达的变化情况

采用ELISA方法检测肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α 、 IL-6水平，用RT-PCR的方法检测肺泡灌洗液中中性粒细胞活化标志物髓过氧化物酶 (myeloperoxidase, MPO)的表达情况，结果显示，与生理盐水对照组相比，LPS组小鼠肺泡灌洗液中MPO的表达显著增高(P<0.05)；与干预对照组相比，干预组小鼠肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-6水平和MPO的表达则显著降低了(P<0.05)；LPS组和干预对照组的TNF-α、IL-6水平和MPO的表达之间则无显著性差异(P>0.05)，见图 2。

三、小鼠肺组织病理变化和肺血管通透性的变化情况

肺组织切片 HE 染色结果显示，相比生理盐水对照组，LPS组和干预对照组小鼠在LPS腹腔注射6 h后肺组织都可见中性粒细胞大量浸润、肺泡结构破坏以及肺泡间隔增厚，表现为典型急性肺损伤；而干预组小鼠的肺组织病变程度较 LPS组和干预对照组明显减轻，见图3-A。

肺血管通透性增加是内毒素性急性肺损伤的典型特征，为进一步明确 ANGPTL4-免疫脂质体对 LPS诱导的肺血管通透性的影响，我们又对肺组织湿干比和肺泡灌洗液蛋白浓度进行了检测，结果显示，LPS 组小鼠的肺组织湿干比较生理盐水对照组明显增加(P<0.05)；干预组小鼠的肺组织湿干比较干预对照组明显降低(P<0.05)；而干预对照组与LPS组之间无显著差异(P>0.05)，见图3-B。肺泡灌洗液中蛋白浓度结果与肺组织湿干比结果相一致，与 LPS 组及干预对照组相比，干预组小鼠的肺泡灌洗液蛋白浓度明显降低(P<0.05)，见图 3-C。

图2 ANGPTL4免疫脂质体对炎症因子TNFα、IL6的分泌及中性粒细胞活化标志物MPO表达的影响；注：A：ELISA检测各处理组小鼠肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α的水平；B：ELISA检测各处理组小鼠肺泡灌洗液中炎症因子IL-6水平；C：RT-PCR检测各处理组小鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞活化标志物 MPO的表达

图3 ANGPTL4免疫脂质体小鼠肺组织病理、肺组织湿干比和肺泡灌洗液蛋白浓度的影响；注：A：各处理组小鼠肺组织切片HE染色结果；B：各处理组小鼠肺组织湿干比；C：BCA法检测各处理组小鼠肺泡灌洗液中蛋白浓度

讨 论

尽管气道护理和保护性机械通气取得了一定的进步，但ALI的发病机制尚不完全明确，临床上还不能完全做到降低其死亡率。ALI以肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤为主要表现，而肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞构成的肺泡毛细血管屏障即血气屏障对于肺脏气体交换、防止血液中物质返流入间质和进入肺泡腔等至关重要，肺微血管内皮细胞通透性增加、血气屏障完整性破坏导致的高通透性肺水肿是ALI的基本病理表现[11]。因此针对高通透性肺水肿，寻找新的肺泡毛细血管通透性的调剂因子进而恢复肺微血管内皮细胞通透性，可能是防治ALI/ARDS，降低其死亡率的有效途径。

细胞因子和炎症介质在ALI中具有重要作用，但由于细胞因子的种类繁多，其调控网络极其复杂，此时仅作用于单一位点的治疗很难获得理想效果。如能逆转ALI的基本病理特征——高通透性肺水肿，可能会降低ALI的死亡率。ANGPTL4基因是ANGPTLs 基因家族的一个成员，在肺、肾、肝脏、垂体、骨骼肌和心脏中均有表达[12-13]。ANGPTL4基因具有多种作用，但其最重要的作用是调节血管发生、脂类代谢、糖类代谢和胰岛素敏感性等[3-5]。血管发生既是机体生长发育的正常生理过程，又是肿瘤、心血管疾病和各种炎性反应的重要病理基础。近期的研究表明：ANGPTL4能显著抑制血管内皮细胞的增殖、趋化性和血管形成，并且显著抑制体内血管内皮生长因子诱导的血管生成和血管渗漏[6-7]。因此，阐明ANGPTL4与血管发生的关系，对于全面认识血管发生的分子机制，了解和防治肿瘤、各种炎症反应等与血管发生相关的人类疾病具有重要意义。

上调基因在动物体内的表达多是通过腺病毒、慢病毒等病毒载体，但是上述病毒载体缺乏血管靶向性，如直接注射ANGPTL4重组腺病毒至ALI动物，会对其他组织的血管产生影响；而血管局部的基因转染亦有其局限性。而免疫脂质体是将特异性抗体粘附于脂质体上，它通过特异性识别表达具有某种抗原的细胞或组织，具有靶向性强、半衰期长等优点[14]，已有应用免疫脂质体成功的靶向转染基因至内皮细胞的报道[15-16]。

本研究通过制备ANGPTL4基因与可以靶向识别血管内皮细胞的抗CD31抗体偶联的免疫脂质体，并转染LPS诱发ALI小鼠，结果显示，转染后的小鼠肺组织 ANGPTL4表达水平明显增高，表明我们构建的ANGPTL4-免疫脂质体转染是有效的。在此基础上，我们继续观察评估ANGPTL4对对LPS诱导的肺组织损伤的影响，结果显示LPS诱导小鼠非损伤后，ANGPTL4表达水平出现应激性上调，继续上调ANGPTL4在小鼠肺内的表达，能够减轻 LPS 诱导的急性肺损伤小鼠肺组织中性粒细胞浸润、减少炎症因子TNF-α 和IL-6的表达，降低肺组织湿干比和肺泡灌洗液蛋白浓度，抑制MPO 的表达。以上结果均提示ANGPTL4-免疫脂质体能有效能够减轻 LPS 诱导的ALI小鼠的肺部炎症损伤反应，因此我们推测ANGPTL4可能是炎症反应的保护性蛋白，ANGPTL4的高表达后影响炎症因子的信号通路如PKC[17]、ERK-MAPK[18]通路等，减少炎症因子的释放，同时维持内皮细胞的稳定性，保护肺损伤，防止炎症因子的渗出[17-18]。我们将在以后的研究中进一步深入探讨其机制，为肺损伤的早期治疗提供更多的理论基础和策略。

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(本文编辑：王亚南)

赵咏梅，王瑞，李新宇，等. ANGPTL4免疫脂质体对急性肺损伤小鼠的治疗作用[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2016， 9(5)： 507-511.

JiangPeng,Email：jipzym@126.com

Objective To investigate the effects of immunoliposomes containing ANGPTL4 on acute lung injury in mice. Methods Liposomes containing ANGPTL4 plasmids were prepared by reverse phase evaporation technique and then combined with CD31 antibody to form the immunoliposomes. Results The results demonstrated that the ANGPTL4 immunoliposome could markedly increase the expression of ANGPTL4 in the lung of ALI mice, decrease the secretion of tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-6(IL-6), and the expression of myeloperoxidase(MPO) in bronchoalveolar lavage fluid of ALI mice. The lung wet dry weight, protein concentration ratio in alveolar lavage fluid were also deceased in ALI mice after ANGPTL4 immunoliposome transferred, hints that ANGPTL4 immunoliposome could reduce the degree of lung lesions, as shown in the results of HE-staining. Conclusion ANGPTL4 immunoliposome has the protective effects on lung injury.

ANGPTL4; Immunoliposome; Acute lung injury; Tumor necrosis factor-α; Interleukin-6; Myeloperoxidase

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.008

新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2013211A062)

830000 乌鲁木齐，新疆医科大学·新疆军区总医院血液科1、 临床医学研究所2、 急诊与危重症科3、 实验动物科4、呼吸内科5

姜鹏，Email：jipzym@126.com

R563

A

2016-08-01)

Effects of immunoliposomes containing ANGPTL4 on acute lung injury in miceZhaoYongmei1,WangRui2,LiXinyu3,HeZhigao3,GuiJunhao2,ZhangDonghui4,WangXiaoyan3,ZhangFeng5,ZhangYu5,JiangPeng5.DepartmentofHematology1;Instituteofclinicalmedicine2;DepartmentofEmergencyandCriticalCareMedicine3;DepartmentofLaboratoryAnimalScience4;DepartmentofRespiratory5,XinjiangMedicalUniversity·XinjiangMedicalUniversity,MilitaryGeneralHospitalinXinjiangofPeople′sLiberationArmy,Urumchi830000,China