瑞舒伐他汀对经缺血再灌注处理的高脂血症小鼠外周血清氧化相关物质浓度的影响

邓旭 赵跃萍 林琳 康景佳 贾大林△

(1.中国医科大学附属第一医院心内科，辽宁 沈阳 110031；2.武警辽宁省总队医院心内科，辽宁 沈阳 110034)



瑞舒伐他汀对经缺血再灌注处理的高脂血症小鼠外周血清氧化相关物质浓度的影响

邓旭1赵跃萍2林琳2康景佳2贾大林1△

(1.中国医科大学附属第一医院心内科，辽宁 沈阳 110031；2.武警辽宁省总队医院心内科，辽宁 沈阳 110034)

目的 探讨瑞舒伐他汀(rosuvastatin)对经缺血再灌注(MI/R)处理后的高脂血症小鼠外周血氧化相关物质浓度及其心肌细胞凋亡相关基因表达的影响。方法 选取性成熟ICR小鼠60只，随机分为三组(每组20只)：A组(假手术组)、B组(心肌缺血再灌注模型组)、C组(瑞舒伐他汀组，造模前连续给予瑞舒伐他汀3 d)，建立心肌缺血再灌注实验小鼠模型，阻断左冠脉前降支(ADC)血流30 min后恢复血供。阻断1 h后测定外周血清中GSH-PX、SOD、ROS、MDA浓度的变化及其前降支供血区心肌组织Bax与Bcl-2基因mRNA水平的表达。结果 C组小鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值低于A组，高于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)；C组小鼠外周血清ROS、MDA高于A组，低于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)；C组小鼠心肌组织中Bax基因mRNA水平明显高于A组，低于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)；C组小鼠心肌组织中Bcl-2基因mRNA水平明显低于A组，高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 瑞舒伐他汀能改善经缺血再灌注后高脂血症小鼠心肌组织的氧化与抗氧化平衡失调并抑制心肌细胞凋亡。

瑞舒伐他汀； 心肌缺血/再灌注； 高脂血症； GSH-PX； SOD； ROS； MDA； 凋亡

心脏冠状动脉介入治疗后缺血组织发生的心肌缺血/再灌注损(MI/R)伤一直是介入治疗需要解决的问题，MI/R损伤与氧化/抗氧化平衡失调导致的血管内皮损伤有关，而氧化/抗氧化平衡失调加重血管内皮细胞发生凋亡[1-2]。瑞舒伐他汀(rosuvastatin)是他汀类降脂药物中的新品种，已经广泛应用于抑制并延缓动脉粥样硬化与冠心病的治疗，能很好地改善血管内皮功能抑制内皮细胞增生，此外还有一定的调节免疫、抑制炎性因子的作用[3]，但该药在MI/R损伤抑制细胞凋亡与调节免疫方面还需进一步研究，本实验以合并高脂血症MI/R损伤ICR小鼠实验动物模型，并给予瑞舒伐他汀进行干预，进一步研究其具体作用机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物 60只性成熟ICR小鼠(雌雄各30只)由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，周龄6～8周，28～32g(雌鼠)，30～34 g(雄鼠)，合格证号SCXK-(京)2012-0002。

1.2 药品与试剂 瑞舒伐他汀为英国阿斯利康公司提供；GSH-PX、SOD、MDA、ROS酶活性检测试剂盒为南京建成生物技术公司提供；血清TG、TC浓度检测试剂盒为上海复星长征有限公司提供；Trizol试剂盒为美国Invitrogen公司提供；RT-PCR检测试剂盒由日本TaKaRa公司提供。

1.3 实验仪器 生物分光光度计为BioPhotometer型，由德国Eppendorf公司提供；超速低温离心机为美国Beckman公司提供；UA-265双光道紫外分光光度计为日本岛津公司提供；RT-PCR仪为美国Sigma公司提供。

1.4 实验动物分组与造模 60只小鼠用随机数字法分为A、B、C三组，每组均为20只，每笼5只饲养(雌雄分开饲养)，饲养温度控制在20～26 ℃，12 h光照，12 h黑暗，颗粒饲料(高脂饲料)喂养28 d，自由饮水饮食，28 d后开始MI/R损伤动物模型的制备。A组(假手术组)、B组(心肌缺血再灌注模型组)、C组(瑞舒伐他汀组，造模前连续给予瑞舒伐他汀3 d)。MI/R损伤模型制备：使用异氟烷吸入麻醉法，麻醉后接小动物呼吸机，沿着胸骨左侧纵向切开皮肤约1.5 cm，逐层分离表皮、皮下组织、肌肉、肋骨、胸膜(从第4肋间穿透胸膜经膈肌进入胸腔)，挤压右胸廓，暴露出心脏，分离心包后暴露出左前降支冠脉(anterior descending coronary，ADC)并将其分离，用丝线(6.0)在ADC起始端打一活结，维持30 min后打开结[4]，A组小鼠只穿线不打结，B、C两组打结，C组造模前3 d连续给予瑞舒伐他汀(每日空腹灌胃5 mg/kg，用0.9%氯化钠溶解配成混悬液现用现配)，B、C两组造模前3 d连续给予相同体积的0.9%氯化钠灌胃，闭锁ADC 30 min，松开后30 min后处死(颈椎脱臼法)小鼠，抽取静脉血，测定氧化与抗氧化酶，切取心脏左室ADC供血区检测凋亡相关基因mRNA水平表达。

1.5 GSH-PX、SOD、ROS酶活性及其MDA浓度测定 抽取1 mL静脉血，注入玻璃试管中，静置10 min，以3 000 r/min离心10 min，分离血清在-70 ℃超低温冰箱内保存待测。按试剂盒说明测定GSH-PX、SOD、ROS活性并检测MDA含量。所取标本均在1周内测定。

1.6 外周血清TG、TC浓度检测 抽取的静脉血保存于10 mL的玻璃试管内，放于高速离心机(3 000 r.min-1)离心5 min后，用微量移液器抽取上层血清1 mL，随后将血清放入容积为1.5 mL的离心管中，将离心管立即放于-30 ℃冰箱中冷冻保存，检测时按试剂盒说明分别检测血清TG、TC浓度，所取标本均在1周内测定。

1.8 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学数据分析，采用方差分析法分析各组小鼠的外周血清GSH-PX、SOD、ROS、MDA酶活性与心肌组织凋亡相关基因Bax、Bcl-2基因mRNA水平表达情况，分析前先进行方差齐性检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 外周血清氧化/抗氧化酶活性 C组小鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值低于A组，高于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)；C组小鼠外周血清ROS、MDA高于A组，低于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)，结果见表1。

注:与A组比较，aP<0.05；与B组比较，cP<0.05。

2.2 凋亡相关基因表达情况 C组中Bax基因mRNA水平明显高于A组(P<0.05)，低于B组(P<0.05)；C组中Bcl-2基因mRNA水平明显低于A组(P<0.05)，高于B组(P<0.05)；C组中Bax/Bcl-2明显高于A组(P<0.05)，低于B组(P<0.05)，两基因mRNA水平表达量间呈负相关性(r=-0.723，P=0.032<0.05)，结果见表2,图 1。

表2 三组ICR小鼠心肌组织Bax、Bcl-2基因相对 GAPDH基因mRNA水平表达量

注: 与A组比较，aP<0.05；与B组比较，cP<0.05。

图1 三组ICR小鼠心肌组织Bax、Bcl-2基因相对 GAPDH基因的相对mRNA水平表达量

3 讨 论

瑞舒伐他汀商品名为可定，它是羟甲基戊二酰辅酶A(hydroxy-methy1-glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶抑制剂中的一种，流行病学调查[5]显示该药物能显著降低心血管事件的发生，并能很好地改善心血管功能。可定除了有很好的降低血脂作用外，还有很好的抗血小板聚集、调节免疫、抗氧化、抗炎作用，这些非降脂作用是目前研究的热点[3]，S.Atar等[6]研究表明连续给予瑞舒伐他汀(10 mg/kg) 3 d，随后造MI/R动物模型，发现大鼠心肌梗死面积明显少于未用瑞舒伐他汀组，戴一等[4]研究表明给予瑞舒伐他汀干预治疗后外周血心肌组织Tunnel表达量明显低于对照组。本实验结果表明，在造模前给予瑞舒伐他汀预处理后可以明显降低心肌组织的Bax基因mRNA水平表达升高Bcl-2基因mRNA水平表达，说明能很好地抑制心肌细胞凋亡，与戴一等[4]研究结果相同。

合并高脂血症的患者往往存在外周血的氧化/抗氧化平衡失调，维生素E等抗氧化剂能改善其氧化/抗氧化平衡失调[7]。他汀类降脂药物有较强的抗氧化作用已经得到了广泛认可[3]。线粒体是细胞内能量物质生成与储存的重要场所，对缺氧缺血敏感性高，正常情况下，细胞内部氧化/抗氧化处于平衡状态，抗氧化体系(SOD、GSH-PX、维生素E、维生素C及其机体自身的调控技能如脂肪酶、蛋白酶、DNA修复酶等)能清除氧化物质，但是缺血时线粒体不能进行有氧氧化而进行无氧酵解，能量产生减少，再灌注血液突然进入时带来的氧气能在蛋白激酶C、髓化过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶催化生成活性氧类物质、单线态氧、过氧化氢和氢过氧基等物质，同时产生大量类脂类物质，大量的ROS、MDA产生，超出了SOD、GSH-PX等酶的清除能力，造成过氧化物质集聚而导致损伤[8-10]。本实验结果显示：C组小鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值低于A组，高于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)；C组小鼠外周血清ROS、MDA高于A组，低于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)，再次证实了瑞舒伐他汀有着很强的抗氧化活力。其抑制凋亡作用可能与其抗氧化作用有关。

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[4] 戴一, 姜铁民, 高超, 等. 瑞舒伐他汀预处理影响小鼠心肌缺血再灌注炎症因子和细胞凋亡[J]. 天津医科大学学报, 2013, 19(5): 380-383.

[5] Nykanea AI, Tuuminen R, Lemstrom KB, et al. Donor simvastatin treatment and cardiac allograft ischemia/reperfusion injury [J]. Trends Cardiovasc Med, 2013, 24(3): 85-89.

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Effect of Rosuvastatin on concentration of oxidative related substances after myocardial ischemia/reperfusion in mouse with hyperlipemia

DengXu1,ZhaoYueping2,LinLin2,KangJingjia2,JiaDalin1.

1.DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110031,China. 2.DepartmentofCardiology,LiaoningProvincialCorpsHospitalofChinesePeople'sArmedPoliceForces,Shenyang110034,China.

Objective To explore the effect of Rosuvastatin on concentration of oxidative related substances after myocardial ischemia/reperfusion in mouse with hyperlipemia and the expression of apoptosis gene. Methods 60 viripotent female ICR mice were randomly divided into A, B, C three groups, every group included 20 mice which were A group (Sham group, Sodium Chloride injected,n=20), B group (Model group, the model of myocardial ischemia/reperfusion,n=20), and C group (MI/R model after given Rosuvastatin last 3 days,n=20). The model of MI/R was made,reperfusion after blocking the anterior descending coronary for 30 min. After blocking ADC 1 h, and that were detected the oxydic (ROS, MDA) and antioxidative (GSH-PX, SOD) index and the gene of Bax and Bcl-2 in the level of mRNA in the cardiac muscle of ADC blood-supply and the concentration of TG, TC in the serum. Results The activity of GSH-PX, SOD in the C group were lower than A group, higher than B group, and the activity of ROS and concentration of MDA in the C group were higher than A group, lower than B group, and there were statistical significantly differences (P<0.05); The expression of Bax in the level of mRNA in the C group were super than A group, lower than B group, and the expression of Bcl-2 in the level of mRNA in the C group were lower than A group, higher than B group and there were statistical significantly differences (P<0.05). Conclusion Rosuvastatin can improve the unbalance of oxydic and antioxidative after myocardial ischemia/reperfusion in mouse with hyperlipemia and inhibit apoptosis of cardiac muscle.

Rosuvastatin； Myocardial ischemia/reperfusion； Hyperlipemia； GSH-PX； SOD； ROS； MDA； Apoptosis

辽宁省自然科学基金项目(2014021066)

R-332,R541.4

A

1000-744X(2016)05-0453-03

2015-08-01)

△通信作者，E-mail: 736724666@qq.com