脑梗死患者MTHFR基因多态性检测的意义

高波 陈杰 余宗涛 李文翠 张吉才△

(1.湖北医药学院附属太和医院检验科,湖北 十堰 442000；2.泰州市姜堰区第三人民医院心内科，江苏 姜堰 225500)



脑梗死患者MTHFR基因多态性检测的意义

高波1陈杰2余宗涛1李文翠1张吉才1△

(1.湖北医药学院附属太和医院检验科,湖北 十堰 442000；2.泰州市姜堰区第三人民医院心内科，江苏 姜堰 225500)

目的 分析脑梗死患者MTHFR C677T基因多态性与劲动脉内中膜厚度及外周血中同型半胱氨酸(HCY)水平的关系。方法 收集脑梗死患者100例，芯片法检测MTHFR C677T基因多态性，根据多态型结果分为CC型、CT型、TT型；检测不同多态型患者内中膜厚度以及外周血中HCY浓度水平。结果 脑梗死患者中MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的检出频率分别为19，49，32%； CC型、CT型、TT型患者内中膜厚度分别为(0.65±0.13)、(0.91±0.31)、(1.29±0.48)，差异具有统计学意义(P<0.05)；CC型、CT型、TT型患者HCY水平分别为(10.03±3.24)、(12.04±2.89)、(14.19±3.03)，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 MTHFR C677T基因突变可能是引起高HCY血症的一个重要遗传因素，并且可能增加脑梗死患者动脉粥样斑块形成的风险。

亚甲基四氢叶酸还原酶； 同型半胱氨酸； 脑梗死； 多态性； 内中膜

脑梗死是一种常见的局限性脑组织软化或坏死疾病，在我国的脑血管疾病中呈逐步增高趋势。引起脑梗死的危险因素很多，如年龄、肥胖、高血糖以及高血压等。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR是叶酸代谢过程中的关键酶，在HCY向蛋氨酸转化以及DNA合成过程中发挥着重要作用。C677T多态性引起的高同型半胱氨酸血症可诱导内皮细胞激活促凝因子，使机体处于高凝状态，从而促进血栓形成。颈动脉内中膜(IMT)增厚往往是早期粥样硬化的一个敏感指标[1]。脑梗死的发病往往带有不确定性，特别对于没有明显症状的急性患者。所以对于脑梗死患者来说预防大于治疗。本文通过检测MTHFR C677T基因的多态性，从基因多态性角度分析MTHFR C677T基因突变与高HCY血症以及内中膜厚度之间的关系，探讨基因多态性在脑梗死发病过程中的作用，为脑梗死的个体化诊治提供一定的理论依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集我院2011年1月至2014年12月门诊或住院脑梗死患者100例，其中男性64例，女性36例，平均年龄(61.4±19.1)岁。脑梗死诊断需符合《全国第四届脑血管病学术会议修订》的标准，需经影像学CT或MRI诊断确诊。排除标准：(1)严重的肝肾功能不全；(2)各种原因导致的出血性脑血管疾病；(3)昏迷病人；(4)后循环脑梗死患者。所有患者抽取肝素钠抗凝血3 mL用于HCY 水平的检查，标本采集后离心留取血浆-80 ℃保存备用，EDTA-K2抗凝血3 mL用于全血基因组DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器 全血DNA提取试剂盒(北京天根)；ND-2000微量核酸定量仪(Thermo公司)；PE7500扩增仪(ABI)；AU2700全自动生化仪(贝克曼)；基因芯片仪，芯片识读仪(上海百傲)；彩色多普勒超声诊断仪(Vivid7，GE公司，美国)； HCY浓度检测试剂盒(北京九强)。

1.2.2 HCY浓度检测 HCY在全自动生化分析仪上进行检测，所有试剂均采用配套试剂盒，定标后测试，正常参考区间按照说明书进行设置。

1.2.3 颈动脉IMT厚度测量 所有检测人员充分暴露颈部，测量部位一般为颈总动脉离分叉处1～2 cm，颈外动脉离分叉处1 cm，颈内动脉离分叉处1 cm。正常IMT厚度≤1 mm，颈总动脉膨大≤1.2 mm。判断标准：将颈总动脉>1 mm，颈总动脉膨大处>1.2 mm并突向管腔内，则判断为粥样斑块形成，并详细记录斑块的基本特征如大小、部位、形态以及回声等。

1.2.4 外周血中DNA提取 EDTA抗凝血采集后需按照试剂盒操作说明提取外周血中的全基因组DNA，若不能及时提取应4℃保存，一般不宜存放超过1周。提取后的DNA经微量核酸定量仪测定其浓度和纯度后进行PCR扩增或者-80℃保存备用。

1.2.5 PCR扩增 提取后的DNA经过PCR扩增获取PCR产物。扩增条件为：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，35个循环；72 ℃ 5 min。获取的扩增产物需进行杂交反应或-20 ℃保存备用。

1.2.6 杂交及芯片识读 对上述PCR产物进行杂交，杂交体系及杂交条件参照说明书进行。杂交结束后将芯片放置于芯片识读仪中对结果进行扫描判定，根据所得结果将所有患者分为CC型、CT型、TT型。

2 结 果

2.1 所有脑梗死患者MTHFR C677T基因多态性分析 100例脑梗死患者中MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的检出频率分别为19%、49%、32%，等位基因频率为C43.5%、T56.5%。脑梗死患者不同基因型(CC型、CT型、TT型)的判读结果见图1。

图1 MTHFR C677T 基因多态性结果

2.2 不同基因型患者IMT、HCY浓度的变化 统计学分析发现，IMT厚度以及HCY浓度均为CC型

表1 不同基因型患者IMT、HCY浓度的变化

注:*P<0.05,△P<0.05。

3 讨 论

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR是叶酸代谢过程中的关键酶，在叶酸代谢过程中起到重要作用。MTHFR有多个位点容易发生突变，其中最常见的基因突变是677位核苷酸突变为CC、CT、TT三种。MTHFR 677位点杂合型CT突变和纯合型TT突变可以影响到该酶的活性，叶酸浓度降低，蛋氨酸合成减少，进而使得HCY淤积过多，产生高HCY血症。颈动脉的内中膜厚度IMT与心脑血管疾病的发生密切相关，通过颈动脉彩超测定IMT厚度是预防脑梗死的一种简单有效、无创、方便、经济的方法。

微阵列技术就是利用分子杂交原理，使同时被比较的标本(用同位素或荧光素标记)与微阵列杂交，并包被于芯片上，通过检测包被芯片杂交信号强度及数据处理，用一种直观图像反映出基因多态性

的分型，常常用于遗传性基因多态性的分析。本文采用DNA微阵列芯片法检测脑梗死患者外周血中MTHFR基因多态性发现，MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的检出频率分别为19%，49%，32%，可以很好的检出MTHFR C677T基因多态性分型。研究[2]表明CT型、TT型的基因突变可以降低MTHFR的酶活性，导致叶酸代谢途径障碍。这就使得突变型的脑梗死患者由于MTHFR酶活性的降低导致高HCY血症，HCY又可以损伤内皮细胞，激活促凝血因子，进而促进纤溶酶激活物抑制剂的表达，抑制硫酸肝素的合成，促进血小板粘附聚集，使得机体处于高凝状态，导致血栓的形成[3-5]，进而增加脑血管疾病发生的风险。而如果通过基因检测，对于突变型的患者摄入一定剂量的叶酸，早期进行叶酸干预，提高酶活性，同样可以维持正常的HCY代谢浓度，降低由于高HCY血症导致的血管损害及并发症的发生。这为脑梗死患者的诊治提供了一定的个体化依据。

本研究发现，无论是IMT厚度，还是HCY浓度，均为CC型

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△通信作者，E-mail：fromzero1121@sina.com