microRNAs在结直肠癌患者粪便中的表达及其临床意义

肖兴元 王永强△ 杨洁 张大平 徐健 杨熊飞

(1.昆山市第一人民医院肛肠外科，江苏 昆山 215300；2.甘肃省人民医院肛肠外科，甘肃 兰州 730000)



microRNAs在结直肠癌患者粪便中的表达及其临床意义

肖兴元1王永强1△杨洁1张大平1徐健1杨熊飞2

(1.昆山市第一人民医院肛肠外科，江苏 昆山 215300；2.甘肃省人民医院肛肠外科，甘肃 兰州 730000)

目的 探讨miR-16、miR-21、miR-29a、miR-106a及miR-143在结直肠癌(CRC)患者中的表达特点，评价粪便中microRNAs的表达水平检测对于CRC的诊断价值。方法：采用病理对照研究方式，选取47例CRC患者以及30例健康体检者进行对比研究，采集纳入人群的粪便标本，应用实时荧光定量PCR技术检测患者检测其粪便中的miR-16、miR-21、miR-29a、miR-106a及miR-143表达水平，并比较16例行CRC根治性手术患者于术前1 d以及术后7 d粪便中的miRNAs的变化情况。结果：CRC患者粪便中的miR-16、miR-21、miR-106a表达水平明显高于健康对照组，在CRC患者肿瘤切除后7 d其粪便的miR-16以及miR-106a的表达水平明显低于术前(P<0.05)。结论 miR-16、miR-21、miR-106a可以作为结直肠癌的新的肿瘤标志物。

结直肠癌； 微小RNAs； 粪便

我国结直肠癌(CRC)发病率逐年增高，结直肠肿瘤的早期诊断和治疗能延长患者生存期，提高生存质量，降低社会医疗成本。成熟的微小RNA(microRNAs，miRNA)是一类不编码蛋白质的单链小RNA，对基因表达起到调节作用[1]。miRNA的特异性表达与肿瘤的发生和发展有关，甚至起到抑癌基因或癌基因的效果。研究[2]发现，常见的miRNAs有十几种，其中常见的有miR-16、miR-21、miR-29a、miR-106a及miR-143。本研究旨在探讨联合检测粪便中的上述标志物在诊断CRC及其主要早期病变CRA中的意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2012年1月至2014年1月间于我院住院治疗的47例结直肠癌患者(结直肠癌组)，其中男29例，女18例，年龄43～73岁，平均年龄(57.2±3.7)岁，均经术后病理确诊为腺癌，入院前未予以任何放化疗处理；其中结肠癌32例、直肠癌15例。病理学类型：中分化30例、低分化17例。伴淋巴结转移29例、无淋巴结转移18例。选取同时期于我院行健康体检者30例作为健康对照组，其中男18例，女12例，年龄42～75岁，平均年龄(55.9±5.3)岁，两组患者的年龄、性别等基本资料间比较无明显差异，具有可比性，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 制备标本 将粪便标本收集后加入40 mL的缓冲液[含有Hanks溶液、10%胎牛粪便以及25 mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液，pH值为7.35]中将其混匀，以200 r/min的速度离心1 min，离心半径18 cm，随后利用孔径为512 μm的滤纸作过滤处理。向滤液中加入80 μL免疫磁珠，在室温下孵育45 min，随后在-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 提取RNA 将500 μL标本置于离心管中，在75 ℃条件下预热5 min，42 ℃条件下孵育1 h，提取RNA。具体步骤：向处理后的样本中加入等体积的TRIzol试剂，混匀，室温下静置5 min；加入200 μL三氯甲烷，振荡15 s后继续静置2 min；4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min，取上清液；加入等体积异丙醇，混匀，-20 ℃沉淀过夜后，4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，弃上清液；向沉淀中加入500 μL质量分数0.7的乙醇，将沉淀洗涤，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，离心半径10 cm，弃上清液；将沉淀晾干，用适量焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液将其溶解，得到纯化后的RNA样本。

1.2.3 miRNAs定量分析 实时定量RT-PCR技术检测10 μL预处理过的RNA样本。粪便标本中的内参照为U6小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)L4J。具体过程：加入1 μL 2 μmol/L引物、1 μL 10 mmol/L=磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)、4 μL 5×反转录缓冲液、1 μL RNase抑制剂、1 μL反转录酶、1 μL 0.1 mol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液。反应总体积为20 μL，在16 ℃中反应5 min，42 ℃中反应1 h，82 ℃中反应5 min。取2 μL反转录获得的cDNA用于实时荧光定量PCR，反应体系为2.5 μL 10×PCR扩增缓冲液、0.5 μL 2.5mmol/LdNTP、1 μL荧光绿染料(SYBRGreenI)、0.2 μL 5U/μL Taq、1 μL扩增引物，加去离子水使反应体系达25 μL。反应条件为95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s，共40个循环，每份样本重复2次。测定mi-R21、miR-106a及其内参照的Ct(thresholdcycle)值，△Ct-Ct目的基因-Ct内参照基因，miR-16、miR-21、miR-29a、miR-106a及miR-143的相对含量为2-△Ct。

2 结 果

2.1 五种miRNAs在CRC患者粪便中的表达水平比较 与健康对照相比，miR-16、miR-21 及miR-106a在结直肠癌患者粪便中的表达水平明显升高，组间比较差异有统计学意义(P<0.05),而miR-29a以及miR-143在两组患者粪便中的表达水平之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 miRNAs在两组间的表达水平比较

2.2 不同分化程度结直肠癌患者的粪便miR-16、miR21 及miR-106a表达比较 根据患者的术后病理诊断结果将47例结直肠癌不同分化程度，将CRC患者分为中分化30例以及低分化17例，结果显示，miR-16、miR-21 及miR-106a表达水平在中、低分化组中表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 不同分化CRC患者的miR-16、 miR-21 及miR-106a表达水平比较

2.3 手术前后结CRC患者的粪便miRNAs水平比较 对于行结直肠癌根治手术治疗的16例患者，比较手术前1 d以及术后7 d的粪便miRNAs的表达情况。结果显示，miR-16以及miR-106a表达水平于术后7 d的表达水平明显降低，组间比较有统计学差异(P<0.05),而miR-21在术后的表达水平无明显变化(P>0.05)，见表3。

表3 手术前后患者的miRNAs水平比较

3 讨 论

现在对于CRC早期诊断的主要方法有粪便隐血检查、结肠镜检查、钡灌肠气钡双重造影以及粪便RNA特异性基因检测等[2]。结肠镜检查的灵敏度虽较高，对于高危人群或疑似患者的检查能够有效降低结直肠癌患者的死亡率[3]。但是其需要较高的检查费用，检查准备工作较为繁琐，检查过程难免痛苦，人群接受率不高。目前还不能进行推广。有研究[4-5]指出结直肠肿瘤特异性DNAs1以及RNAs等标志物的检测效果较好，其中miRNA可能作为一个预后的良好指标。有研究[6]指出不同的肿瘤都具有各自不种类型的特异性miRNAs表达谱，应用高通量微阵列芯片技术分析了前列腺癌、大肠癌、卵巢癌、乳腺癌及肺癌粪便miRNAs表达谱后发现，通过对患者的粪便miRNAs表达谱进行检测能够有效辨别肿瘤的类型。S.Mi等[7]研究证实miR-106a以及和miR-173p在结直肠癌患者的血浆中明显表达升高，在肿瘤切除术后表达水平明显下降。此外，研究[8]指出miR-21在结直肠癌以及食管癌患者的粪便中表达水平上升，提示其有可能成为多种肿瘤的诊断和预后指标。通过本次研究结果可以看出，相比于健康对照组，CRC患者粪便中的miR-16、miR-21 及miR-106a表达水平明显上升(P<0.05),但是miR-29a以及miR-143a表达水平则无明显变化，miR-16、miR-21 及miR-106a在低分化和中分化CRC患者粪便中表达水平无明显差异，提示miR-16、miR-21 及miR-106a异常高表达有助于早期诊断CRC，但无法鉴别诊断中、低分化程度的CRC。通过比较CRC根治术患者术前、术后粪便中的miRNAs表达水平可以看出miR-16以及miR-106a在患者术后7 d的表达水平明显下降，且趋于正常水平，提示粪便中上升的miR-16以及miR-106a可能来源于肿瘤组织的释放，术后对其监测有助于评判患者的预后。

[1] 张人华,邹美平， 李珀，等.KLF6、KLF4及APC基因蛋白在结直肠癌中的表达和意义[J].贵州医药,2013,37(7):579-581。

[2] Huang Z,Huang D,Ni S.Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer[J].International Journal of Cancer,2010，127(1)：118-126.

[3] 王海艳，许春伟，吴永芳，等.结直肠癌患者肿瘤组织中KRAS和BRAF基因突变的分子病理检测分析[J].贵州医药,2015，39(11):961-963.

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[6] Osada H,Takahashi T.let-7 and miR-17-92:small sized major players in lung cancer development[J].Cancer Science,2011，102(1)：9-17.

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昆山市科技计划项目合同 (项目编号：KS1340)

R735.3+5

B

1000-744X(2016)05-0478-02

2016-01-03)

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