植物性食品农药残留检测中高效液相色谱—串联质谱法的应用

杨昊，公丕学，王骏，刘艳明，薛霞，卢兰香，祝建华

植物性食品农药残留检测中高效液相色谱—串联质谱法的应用

杨昊，公丕学，王骏，刘艳明，薛霞，卢兰香，祝建华

（山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250000）

目前，食品安全中最大瓶颈是复杂基质中痕量成分的多残留组分的检测分析，为解决这一难题，提出了一种分离能力强、灵敏性高及检测效率快的高效液相色谱—串联质谱法（HPLC—MS/MS），并联合复合分子印迹固相萃取技术对样品前处理过程的提取及净化步骤进行优化，选用不同种类的果蔬、谷物作为样本基质，对10种三嗪类及磺酰脲类农药残留进行检测分析，结果表明目标化合物的回收效率在63.2%~118.5%之间，相对标准差为 1.82~14.5%，该方法操作便捷、成本小且可靠性高，能够满足植物性食品农药残留的日常检测。

植物性食品；高效液相色谱—串联质谱法；除草剂；农药残留

植物性食品是能够为人类提供能量或营养物质的主要来源，其安全问题关系着每一个人的生命健康，但因为农药的违规违法或是超规格使用，加之检测体系的不健全，很容易造成不同程度的农药残留问题，进而埋下安全隐患。而且，现代农药种类繁多，化合物组成复杂，传统的气相色谱法（GC）、液相色谱法（HPLC）、气相—色谱质谱联用法（GC-MS）等检测方法，检测的精准性和全面性有限、覆盖的农药数量较少，且操作过程繁琐、有机溶剂使用量较大，成本较高[1]，迫切需要引入一种高效、便捷且检测限低农药多残留检测技术，针对此，本文建立了一种高效液相色谱—串联质谱法，其首先利用色谱将复杂混合物分离为单一的组分，而后使用质谱检测技术获取化合物分子离子及碎片信息，并联用复合分子印迹固相萃取技术对样品前处理过程进行优化，完成了不同植物性食品的10种三嗪类及磺酰脲类农药残留的监测分析，检测效率及精准度均有显著性提升，该方法分离能力强、灵敏度高且选择性好，可以对复杂基质中的痕量物质进行检测分析，将在未来农药残留检测分析中发挥重要的作用。

1 实验部分

1.1 药品与试剂

乙腈、甲醇(色谱纯，Fisher公司)；甲酸、乙酸（色谱纯，阿拉丁）；正己烷（色谱纯，美国MREDA公司）；10 种农药标准品（纯度在96%-98%之间，美国Sigma-Aldrich公司），实验用水为经过Milli-Q超纯水系统（Merck Millipore，法国）过滤提纯后的高纯水，复合分子印迹固相萃取柱（MixedC8/SiSCX固相萃取柱，美国Agilent公司）[2]。

标准溶液配制：单一标准溶液，从选取的10种农药标准品中准确称取相应的分量，将其置于10 mL容量瓶之中，并在其中放入定量甲醇溶液作为稀释剂，以滴管方式将其加入容量瓶以便进行精准配制，最终制成的单一标准工作液浓度为 500 μg/mL，在-20 ℃温度予以保存；混合标准溶液，从上述农药单一标准溶液中吸取1 mL的溶液，放入50 mL溶液瓶中，以乙腈将其稀释定容成为质量浓度均为10 μg/mL的混合工作液，于4 ℃下避光保存。

1.2 仪器与实验装置

选用Agilent1290/6460超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（美国Agilent公司），配备PV-550纳喷雾离子源(美国New Objective公司)以及Analyst1.6.1色谱工作站，电喷雾离子化源(ESI)(美国ABI公司)、氮吹仪（GIPP-AUTO-12S，上海继谱电子科技有限公司），Syncore Analyst平行定量浓缩仪（瑞士BUCHI公司），V-710真空泵（瑞士BUCHI公司）、B-740再循环冷却系统，XPN-100/90/80超速离心机（美国Beckman公司）。

1.3 色谱与质谱条件

色谱：Agilent ZORBAX Rx-C8 HPLC液相色谱柱（粒径5 µm,4.6 mm×250 mm）流动相A为0.1%的甲酸水溶液[3]，流动相B为乙腈，流速：0.2，柱温：30 ℃，进样量：3 μL,采用梯度洗脱程序：0~5 min,A∶B=10∶90;5~10 min,A∶B=10∶90;10~12 min,A∶B=40∶60;12~13 min,A∶B=70∶30;流速：0.2 mL/min。

质谱：UPLC系统配有三级四级杆质谱，离子源为电喷雾电离（ESI），温度设定为450℃，多反映监测（MRM）模式进行分析，正离子扫描，离子源雾化器压力Gas1、辅助加热气压Gas2、气帘气（CUR）均设定为30 Psi，喷雾电压（IS）:5 500 V[4]，而具体的质谱条件如表1所示。

表1 10种农药的质谱检测条件（碎片离子中标*为定量离子）

1.4 样品前处理

提取：准确称取2 g样品放入50 mL离心管中，将15 mL乙腈添至其中，漩涡混匀2 min,于震荡器上剧烈震荡30 min, 在5 000 r/min条件下离心5 min，移取两次上层清液予以合并（所选样品中花生、玉米具备高油脂性，可将用乙腈饱和的20 mL正己烷溶液添入其中，并予以高速震荡混合，将己烷层剔除，在50 ℃下将所提取的清液置于定量浓缩仪中浓缩至干，然后再以2 mL乙腈进行再溶解，从中吸取1 mL以以备后续实验使用。

净化：用3 mL乙腈活化MixedC8/SiSCX固相萃取柱，且柱子中的乙腈不能完全流干，在固相萃取柱中加入1 mL上样液，过柱速度为每分钟0.3 mL，全部用完为止。首要步骤用1 mL水对柱子进行淋洗，待水流净，再用6 mL酸醇溶液（以1∶9的乙酸与甲醇配制而成）及2 mL甲醇溶液对柱子进行淋洗，在50 ℃下用氮气吹干仪将获得洗脱液吹干，以1 mL乙腈进行再溶解，并通过流动相0.1%甲酸加水稀释后待测定。

再生：用乙酸与甲醇以1∶9配置成为4 mL酸醇溶液对MixedC8/SiSCX柱淋洗3次以上，直至没有目标物洗脱，可多次重复使用小柱。

2 结果与讨论

2.1 提取剂的选取

结合以往的研究经验，在不同基质中添加浓度为10 μg/kg的甲醇、乙酸、乙腈、丙酮等溶液，可知，这4种溶剂的提取效率依次为：80%~115%、45%~80%、46%~89%、59%~110%，其中，色素含量较高的为丙酮、甲醇提取液，而溶液净度及提取效率较高的为乙酸乙酯，，尤其是乙腈对农药的溶解度较大，且分子小，渗透力强，固以乙腈作为提取液，在其中添加硫酸镁来去除水分，使得农药更好的溶于乙腈，便于后续净化。

2.2 净化方法的确定

植物性食品中大豆、玉米是高油脂的样品，其会影响提取液的澄清度，为此，须用正己烷对提取的溶液进行液萃取，以将多余的油脂类干扰物剔除，然后再过柱完成净化[5]，而正己烷可在乙腈中溶解，通过获得乙腈饱和正己烷来净化，可显著提升回收率，以满足后续检测需求。

2.3 固相萃取过程优化

比较甲醇、乙腈、酸醇［乙酸：甲醇（V/V）=1∶9］、水等 4 种提取溶液的吸附性能，结果表明，提取溶液选用水和乙腈时，可实现对多数农药组分的吸附，但乙腈会造成噻吩磺隆、单嘧磺隆部分损失[6,7]，因此，只以水为淋洗剂，而且，与乙腈相比，甲醇的氢键作用常数较大，印迹聚合物在其中的吸附性能最低，以甲醇为洗脱溶剂为最佳选择，且为降低氢键作用力，可适当添加乙酸，以实现目标化合物的全部洗脱。同时，通过甲醇、酸醇及两者融合的洗脱能力的对比，使用2 mL甲醇、6 mL酸醇可实现洗脱完全，并确保回收率。

2.4 色谱和质谱条件的优化

色谱分离时，流动相、进样介质及体系均会造成色谱峰形， 使用乙腈-水作为流动相时，化合物的色谱峰性变宽、灵敏度降低，呈弱酸性的磺酰脲类农药，以甲酸或醋酸酸化，并将0.1%甲酸加入水中可改变化合物的峰形，加快化合物的例子化，为此，最终选择乙腈-0.1%甲酸为最佳流动相，10种农药的分离检测将在13 min内完成，结果显示在既定时间内所有目标化合物均出峰，且峰形尖锐，分析效率较高，分离度较好。

2.5 方法学考察

线性范围与定量限：完成上述优化步骤后，可据此配置相关的混合工作液以备后续实验分析，轴横向坐标设定为质量浓度，轴纵向坐标设定为峰面积，由此完成标准曲线的绘制并进行线性回归[8]，所得结果表明10种农药在浓度范围为0.5~40 ng/mL时，线性关系良好，相关系数取值范围为0.997 1~0.999 9，具备实验的可行性；同时，以S/N≥10确定方法的定量限为0.38~2.04 μg/kg[9]，具体结果如表2所示。

方法的准确度与精密度：选取空白样品基质，将配制的质量浓度为5、10、20 μg/kg的混合标准溶液加入其中， 依照确定的提取、净化方法在选定的UPLC-MS/MS 条件下进行测定，每个浓度水平重复测定6次，计算所得平均回收率为63.2%~118.5%，相对标准差RSD为1.82~14.5%，满足了复杂基质中多组分痕量残留检测需求。

表2 10种农药的相关系数、定量限与回收率

表3 10种样品的HPLC-MS/MS检测结果

2.6 实际样品测定

随机购买10种不同的果蔬、谷物作为研究样品，根据上述方法对其进行HPLC-MS/MS测定，结果如表3所示，小麦、玉米、大豆、甘蔗、菠萝、花生等6种植物性食品中均含有不同种类的农药残留，根据GB2763-2014《食品中农药最大残留限量》的相关规定，噻吩磺隆在小麦、玉米、大豆及花生中的最大残余限量为0.05 mg/kg，而实测结果显示其在这四类植物性作物中的残余量分别为4.259 1、2.316 8、1.271 3、3.125 4 mg/kg、均明显超出最大残余限量；莠灭净在菠萝中的最大残余限量为0.2 mg/kg，在甘蔗中的最大残余限量为0.05 mg/kg，但检测结果该种农药成分在这两类作物中的残余量各为1.235 6、0.271 4 mg/kg，也存在超标现象，同时，西玛津在菠萝中的最大残余限量为0.1 mg/kg，在甘蔗中的最大残余限量为0. 5 mg/kg，实验检测的残余量也严重超标，这说明菠萝、甘蔗两类作物在未来种植过程中应该控制相应农药的使用量；而氰草津在玉米中、单嘧磺隆在小麦中的最大残余量分别为0.05、0.1mg/kg，实测结果也存在过限的问题。

3 结束语

通过高效液相色谱—串联质谱法并结合复合分子印迹固相萃取技术建立的植物性食品农药残留检测方法，依据样品种类给予不同的净化方法，有效提升了净化效果，突破了基质干扰问题，且操作更为简单、灵敏度高、选择性强，对农药残留的分离效果更好，根据研究结果显示，在0.5~40 ng/mL浓度范围内10种农药线性关系良好，相关系数最小值为0.997 1，而且，分别在5、10、20 μg/kg混合标准液下对样品进行了重复测定，10种目标化合物的回收率范围为63.2%~118.5%，RSD为1.82~14.5%，定限量为0.38~2.04 μg/kg，满足了复杂基质多组分残留的高效、准确检测，对于未来农药残留检测技术的优化发展有一定的参考价值。

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［2］高志斌. 高效液相色谱-串联质谱法测定各类食品中丙烯酰胺的实际应用[J]. 科技展望,2016,26(33):94-95.

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［5］彭西甜,胡西洲,沈菁,龚艳,彭立军,冯钰锜. 高效液相色谱-串联质谱法在食品中农药残留分析中的应用[J]. 分析科学学报,2014,30(04):572-577.

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Application of High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Determination of Pesticide Residues in Vegetable Foods

，，，，，，

（Shandong Institute of Food and Drug Inspection, Shandong Jinan 250000，China）

The biggest bottleneck in food safety was the detection of multi residue components of trace components in complex matrix, in order to solve this problem, a high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC - MS/MS) with high separation efficiency, strong sensitivity and fast detection was proposed, and molecular imprinting solid phase extraction technique was used to optimize the sample pretreatment and purification steps. Different kinds of fruits and vegetables were chosen as the samples, 10 kinds of triazine and sulfonylurea pesticide residues were detected. The results showed that the recovery efficiency of the target compounds was in the range of 63.2%~118.5%, the relative standard deviation was 1.82%~14.5%.This method is easy to operate, and has low cost and high reliability, so it can satisfy the daily detection of pesticide residues in vegetable foods.

Vegetable foods; HPLC - MS/MS; Herbicide; Pesticide residues

TQ457

A

1671-0460（2017）12-2532-03

2017-08-28

杨昊（1986-），男，山东省乐陵市人，工程师，研究方向：食品中农药兽药残留在液相色谱质谱中检测方法研究。