妊娠早期复发性流产患者妊娠组织增殖与凋亡的研究

孙 莉，陈 琳,马继红

妊娠早期复发性流产患者妊娠组织增殖与凋亡的研究

孙 莉，陈 琳,马继红

目的 分析妊娠早期复发性流产(recurrent spontaneous abortions, RSA)患者妊娠组织(绒毛滋养细胞及蜕膜细胞)增殖与凋亡的情况，并探讨其可能致病机制。方法 选取我院2014年1月—2015年12月妇产科收治的妊娠12周内的RSA患者60例(RSA组)，药物流产者60例(药物流产组)，人工流产者60例(人工流产组)。采用DNA缺口原位末端标记技术检测3组胎盘绒毛组织和蜕膜组织细胞凋亡情况，采用免疫组织化学染色法检测3组胎盘绒毛和蜕膜组织中胎盘生长因子(placenta growth factor， PLGF)和凋亡相关因子Caspase-3的表达水平，并进一步分析RSA组中二者表达的相关性。结果 RSA组胎盘绒毛及蜕膜组织凋亡指数(apoptotic index, AI)均明显高于药物流产组和人工流产组，差异均有统计学意义(P均<0.01)。RSA组胎盘绒毛组织和蜕膜组织中PLGF表达水平均显著低于药物流产组和人工流产组(P<0.01)，Caspase-3表达水平均显著高于药物流产组和人工流产组(P<0.05)。相关性分析显示，RSA组胎盘绒毛及蜕膜组织中Caspase-3与PLGF的表达呈负相关(r=-0.891,P=0.004;r=-0.927，P=0.001)。结论 妊娠早期RSA的发生可能与绒毛组织和蜕膜组织中，PLGF的表达不足导致绒毛及蜕膜细胞增殖障碍，以及Caspase-3表达增加导致绒毛及蜕膜细胞过度凋亡有关。

流产,习惯性；妊娠初期；绒毛；蜕膜；细胞增殖；细胞凋亡

复发性流产(recurrent spontaneous abortions, RSA)是指与同一性伴侣发生2次及其以上的自然流产[1-4]，其中早期流产占80%以上。导致RSA的原因除常见的遗传、内分泌失调、生殖道解剖异常、免疫功能异常、血栓前状态、感染及环境因素外[5]，仍有40%～60%的RSA原因不明[6]，故对妊娠早期RSA的发病机制进行探讨有着重要的临床意义。近年研究发现，胎盘组织凋亡和增殖的平衡状态对维持正常妊娠至关重要，胎盘绒毛滋养细胞和蜕膜组织中凋亡增多及增殖不足均可导致病理性妊娠甚至自然流产的发生[7-8]。血管生成是创伤愈合、肿瘤生长和转移等多种生理和病理现象均会涉及的重要过程[9]。胎盘生长因子(placenta growth factor， PLGF)主要由滋养细胞分泌，是血管生长因子及抗血管生成因子的重要代表物质[10-13]。细胞凋亡是正常体细胞维持稳定的自我保护机制，Caspase-3是凋亡级联反应过程中的一种活化酶，在细胞凋亡中起着重要作用。本研究通过免疫组织化学染色(组化)检测妊娠早期RSA患者胎盘绒毛及蜕膜细胞中PLGF与Caspase-3的表达水平，以探讨妊娠早期RSA患者胎盘绒毛及蜕膜细胞增殖及凋亡的关系。

1 资料与方法

1.1 纳入及排除标准 ①纳入标准：年龄在15～40岁，符合美国妇产科协会2010年关于RSA的诊断标准；未接受其他治疗；临床资料完整。②排除标准：合并子宫肌瘤及其他肿瘤疾病；合并严重呼吸、循环系统疾病[14]。患者均自愿参加并签署知情同意书，且本研究经医院医学伦理委员会审核同意。

1.2 对象与分组 随机选取我院妇产科2014年1月—2015年12月收治并确诊的妊娠12周内RSA患者60例(RSA组)，药物流产者60例(药物流产组)，人工流产者60例(人工流产组)作为研究对象。3组基线资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 3组流产患者一般资料比较±s)

1.3 研究方法 收集所有患者胎盘绒毛及蜕膜组织，将获得的组织用无菌0.9%氯化钠注射液冲洗，除去血凝块后用10%甲醛固定。常规脱水、石蜡包埋、连续切片，片厚4 μm，常规HE染色，观察绒毛和蜕膜形态。将载玻片置于浓度为0.2%～0.5%的洗洁精中浸泡1 h后，冲洗风干。

采用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)对绒毛及蜕膜组织中细胞凋亡情况进行检测，并设定阳性和阴性对照。试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，操作按试剂盒说明书进行。光镜下见细胞核有棕黄色颗粒计为阳性，即为凋亡细胞。每张切片随机选取不重叠的5个高倍视野(200倍)计算凋亡指数(apoptotic index, AI)，AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

采用免疫组化SP法检测胎盘绒毛及蜕膜组织中Caspase-3和PLGF含量[15]。Caspase-3兔抗人多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，PLGF兔抗人多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。按常规程序操作，一抗工作液浓度Caspase-3为1︰200，PLGF为1︰100，DAB显色。阴性对照采用磷酸盐缓冲液代替一抗。Caspase-3阳性表达为细胞质和细胞核中有黄色颗粒，PLGF阳性表达为胞质中有棕黄色颗粒，每张切片随机选取5个不重叠的高倍视野(200倍)，用Motic Med数码医学影像软件测定每个视野阳性染色部位的平均光密度值，代表绒毛及蜕膜组织中PLGF、Caspase-3表达水平，光密度值越大表示其表达越强[16]。

1.4 观察指标 比较3组患者胎盘绒毛及蜕膜组织AI值和PLGF、Caspase-3的表达水平，并进一步分析RSA患者中PLGF与Caspase-3表达的相关性。

2 结果

2.1 AI值比较 TUNEL检测显示，RSA组胎盘绒毛及蜕膜组织AI值均明显高于药物流产组和人工流产组，差异均有统计学意义(P均<0.01)；药物流产组和人工流产组胎盘绒毛及蜕膜组织AI值比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组流产患者胎盘绒毛 及蜕膜组织凋亡指数比较±s，%)

注：RSA组比较，bP<0.01

2.2 PLGF表达 PLGF主要表达于合体滋养细胞和蜕膜细胞的胞质内。RSA组胎盘绒毛组织和蜕膜组织中PLGF表达水平均显著低于药物流产组和人工流产组(P<0.01)；药物流产组和人工流产组胎盘绒毛组织和蜕膜组织中PLGF表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.3 Caspase-3表达 Caspase-3主要表达于合体滋养细胞的胞质和蜕膜细胞的胞核及胞质中。RSA组胎盘绒毛组织和蜕膜组织中Caspase-3表达水平均显著高于药物流产组和人工流产组(P<0.05)；药物流产组和人工流产组胎盘绒毛组织和蜕膜组织中Caspase-3表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表3 3组流产患者胎盘绒毛组织 和蜕膜组织中PLGF表达水平比较

注：与RSA组比较，bP<0.01

表4 3组流产患者胎盘绒毛组织 和蜕膜组织中Caspase-3表达水平比较

注：与RSA组比较，aP<0.05

2.4 相关性分析 RSA组胎盘绒毛组织和蜕膜组织中Caspase-3与PLGF的表达呈负相关(r=-0.891,P=0.004;r=-0.927，P=0.001)。

3 讨论

近年来，随着分子生物学关于细胞增殖与凋亡机制研究的深入，发现细胞的增殖和凋亡决定着组织细胞的数量。在妊娠生理过程中妊娠组织凋亡和增殖的平衡至关重要，妊娠组织凋亡或增殖异常会影响胎盘生长、成熟及功能，引起病理性妊娠甚至自然流产的发生[17]。有研究发现，RSA患者绒毛组织中可见特征性的细胞凋亡，且较正常妊娠患者绒毛组织中显著增加，说明滋养细胞过度凋亡可能是RSA发病原因之一[18]。目前在细胞凋亡研究中广泛采用TUNEL染色法，其可对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，准确反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，并可检测出极少量的凋亡细胞。本研究即采用TUNEL染色法检测妊娠组织的凋亡情况。

Caspase家族是一系列含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在细胞凋亡中起着重要作用。Caspase-3处于Caspase凋亡传导通路的下游，其高表达可启动线粒体/细胞色素c及Fas介导的凋亡通路，一旦活化将促使胎盘绒毛细胞大量凋亡，阻碍孕卵的发育，流产将不可避免[19]。血管发生和血管化是妊娠早期胚胎发育和胎盘形成的基础，此过程主要由血管生成因子调控。血管生成因子调节异常会影响胚泡发育、受精卵着床、滋养细胞侵入、胎盘血管生成及网络构建等一系列妊娠生理过程[20-21]。PLGF属血管内皮生长因子家族成员，作为参与血管发生和血管通透性调节的重要因子，其参与生殖过程各阶段，具有诱导内皮细胞增殖、抗内皮细胞凋亡、增加血管通透性、促进滋养细胞增殖与分化等多种生物学作用[22]。有研究显示，PLGF可促进绒毛外滋养细胞的浸润活性及胎盘血管网络形成，有助于正常胎盘的形成，并维持妊娠生理过程[23]。

本研究结果显示，RSA组胎盘绒毛组织及蜕膜组织中Caspase-3水平显著高于药物流产组和人工流产组，提示Caspase-3可能与RSA的发生有关。因为Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键“诱导者”和“执行者”，其高表达可使大量细胞凋亡，阻碍绒毛生长，极有可能是导致自然流产的重要原因之一。本研究结果还显示，RSA组胎盘绒毛组织及蜕膜组织中PLGF表达水平显著低于其他两组，提示PLGF可能与RSA的发生有关，其在胎盘组织中的异常表达可能参与了早期胚胎停育的发生。本研究相关性分析显示，RSA组胎盘绒毛组织及蜕膜组织中Caspase-3与PLGF的表达呈负相关，提示凋亡因子与PLGF两因素间存在潜在相互作用。

综上所述，RSA的发生可能与Caspase-3表达增加导致胎盘绒毛及蜕膜细胞过度凋亡，以及PLGF表达不足导致胎盘绒毛及蜕膜细胞增殖障碍有关，两因素综合作用使得维持绒毛正常发育的平衡状态遭受破坏。本研究因病例采集范围及时间有限，病例数较少，有待进一步大样本的深入研究。

[1] 肖世金,赵爱民.复发性流产病因学研究进展[J].中国实用妇科与产科杂志,2014,30(1):41-45.

[2] 邓金枝.复发性流产76例临床分析[J].中国医药科学,2014,4(14):201-202,211.

[3] 李莉.小剂量阿司匹林联合肝素与地屈孕酮片治疗复发性流产的效果[J].中国医药,2015,10(11):1660-1662.

[4] 赵芳芳,蒋晓莉,郭谊,等.复发性流产与自身免疫性抗体的相关性研究[J].中国医药,2013,8(11):1619-1620.

[5] 马芳芳,王厚照,田艳,等.三种自身抗体与复发性流产的关系研究[J].临床军医杂志,2013(4):383-384.

[6] Achmann J， Raue A， Schilling M，etal. Division of labor by dual feedback regulators controls JAK2/STAT5 signaling over broad ligand range[J].Mol Syst Biol, 2011,19(7):516.

[7] 刘立群,游泽山,李婕,等.SOCS3诱导反复自然流产患者蜕膜及绒毛组织Th1/Th2转换的作用[J].中山大学学报(医学科学版),2013,34(4):574-577.

[8] 吕兴钰,艾海权,蔡霞,等.正常妊娠反复自然流产绒毛及蜕膜组织中细胞因子信号转导负调控因子的表达:改变Th1/Th2平衡调节可影响妊娠结局[J].中国组织工程研究,2012,16(18):3333-3336.

[9] Lindemann C， Hackmann O， Delic S，etal. SOCS3 promoter methylation is mutually exclusive to EGFR amplification in gliomas and promotes glioma cell invasion through STAT3 and FAK activation[J].Acta Neuropathol， 2011，122(2):241-251.

[10]张惠军,郭喜朝,彭启华,等.急性心肌梗死患者血清胎盘生长因子与近期心功能的关系[J].武警后勤学院学报·医学版,2015(9):700-702.

[11]何剑英,王静依,颜艳.孕妇血浆胎盘生长因子与死胎、子痫前期等妊娠结局的相关性研究[J].海南医学院学报,2014,20(3):401-404,408.

[12]杨美霞,宋芳,董文杰,等.白细胞介素-10在反复自然流产患者绒毛及蜕膜组织中的表达[J].中国医药科学,2013,3(21):11-12,15.

[13]李晓涛,魏立业,任运军,等.血清胎盘生长因子与冠状动脉侧支循环的关系[J].首都医科大学学报,2012,33(6):833-836.

[14]李哲,韩清,刘彩娥.子痫前期子宫螺旋动脉血流与孕妇血清胎盘生长因子表达的相关研究[J]. 中国医药科学,2014,4(1):18-20,30 .

[15]Wang Y, Lewis D F ，Gu Y，etal. Elevated maternal soluble Gp130 and IL-6 levels and reduced Gp130 and SOCS-3 expressions in women complicated with preeclampsia[J].Hypertension, 2011，57(2):336-342.

[16]刘庆芝,黄山鹰,姚吉龙,等.反复自然流产患者外周血中Th1/Th2型细胞因子的表达及其意义[J].东南大学学报(医学版),2011,30(4):565-568.

[17]Saraveols S H, Li T C. Unexplained recurrent miscarriage: how can we explain it?[J].Hum Reprod, 2012，27(7):1882-1886.

[18]李泽莲,程玲慧,向卉芬,等.凋亡基因与早期妊娠结局的关系[J].中国实用妇科与产科杂志,2013,29(6):516-518.

[19]支佩颖,王雪舟,林素云,等.血清CA125水平与先兆流产预后的关系[J].中国基层医药,2012,19(4):509-510.

[20]Muttukrishna S, Swer M, Suri S，etal. Soluble Flt-1 and PlGF: new markers of early pregnancy loss?[J].PloS One， 2011，6(3):e18041.

[21]Lash G E, Innes B A, Drury J A，etal. Localization of angiogenic growth factors and their receptors in the human endometrium throughout the menstrual cycle and in recurrent miscarriage[J].Hum Reprod， 2012，27(1):183-195.

[22]Fernandez-Valdivia R， Mukherjee A， Mulac-Jericevic B，etal. Revealing progesterone's role in uterine and mammary gland biology: insights from the mouse[J].Semin Reprod Med， 2005，23(1)：22-37.

[23]郭芳芳,杨洁霞.胎盘生长因子与妊娠关系的研究进展[J].中国妇幼保健,2014,29(36):6173-6175.

A Study on Proliferation and Apoptosis of Pregnancy Tissues in Early Recurrent Spontaneous Abortion Patients

SUN Li， CHEN Lin， MA Ji-hong

(Department of Gynecology and Obstetrics, Bethune International Peace Hospital of PLA， Shijiazhuang 050082， China)

Objective To analyze proliferation and apoptosis conditions of pregnancy tissues (villi nutrient and decidua cells) in early recurrent spontaneous abortion (RSA) patients and to investigate the possible pathogenic mechanisms. Methods A total of 60 early RSA patients within 12 weeks of pregnancy (group A), medical abortion of 60 patients (group B) and 60 patients with induced abortion (group C) during January 2014 and December 2015 were recruited in this study. In three groups, apoptosis conditions of villi nutrient cells and decidual cells were detected by using DNA in situ end labeling method, and then expressions of placenta growth factor (PLGF) and apoptosis related factors Caspase-3 were detected by using immunohistochemical staining method. The correlation between PLGF and Caspase-3 expressions was analyzed in group A. Results In group A, values of apoptosis index (AI) of villi and decidual cells were significantly higher (P<0.01); expressions of Caspase 3 and PLGF were significant lower (P<0.01), and Caspase-3 expressions in villi and decidua cells were significantly higher than those in group B and C (P<0.05). Correlation analysis showed that Caspase-3 and PLGF expressions were negative correlation in group A (r=-0.891,P=0.004;r=-0.927,P=0.001). Conclusion The pathogenesy of early RSA may be related to proliferation disorder of villi and decidua cells induced by PLGF poor expression and excessive apoptosis of villi and decidua cells induced by increasing Caspase-3 expression.

Abortion, habitual; Pregnancy trimester, first； Villi； Decidua; Cell proliferation; Apoptosis

河北省计划生育委员会2011年科研计划课题(2011-A21)

050082 石家庄,解放军白求恩国际和平医院产科

R714.21

A

1002-3429(2017)01-0094-04

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.01.031

2016-08-20 修回时间：2016-10-30)