CRISPR/Cas9技术及其在海洋生物中的应用现状与展望

李响董波,2,3

(1.中国海洋大学海洋生命学院,青岛266003;2.中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所,青岛266003;3.青岛海洋科学与技术国家实验室,青岛266100)

CRISPR/Cas9技术及其在海洋生物中的应用现状与展望

李响1董波1,2,3

(1.中国海洋大学海洋生命学院,青岛266003;2.中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所,青岛266003;3.青岛海洋科学与技术国家实验室,青岛266100)

CRISPR系统是细菌对抗噬菌体和外源质粒的一种获得性免疫系统,基于细菌Ⅱ型CRISPR系统开发的CRISPR/Cas9技术体系是目前适用范围最广、效率最高的基因编辑工具。与锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)技术和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases,TALEN)技术相比,CRISPR/Cas9具有简便、高效、廉价等优点。目前CRISPR/Cas9技术已经成功应用于大多数模式生物的基因编辑,但其在海洋生物中的应用才刚刚开始。文章将从CRISPR/Cas9技术入手,介绍其发展过程、作用机制、应用现状,并分析其在海洋生物中的应用与前景展望,以期推动这一技术在更多海洋生物研究中得到应用,解决限制海洋生物功能基因验证和深度开发海洋生物基因资源等方面的难题。

CRISPR/Cas9;基因编辑;海洋生物;功能验证;基因资源

21世纪被称为“海洋的世纪”,占地球表面积71%的海洋,孕育着数量庞大的海洋生物,截止2007年中国海域记录的海洋生物种类为22629种[1],并不断有新报道的海洋物种。这些海洋生物中一部分是人类重要的食物来源,如鱼虾贝藻等经济种类都是我国人民餐桌上的美味。另外,由于某些海洋生物为适应海洋环境所进化形成的独特身体结构,使其成为生物学基础研究的优良模式生物。海胆是人类较早使用的模式生物,早在19世纪90年代,科学家就用海胆作为材料开展了受精生物学和发育生物学的研究,证明了动物胚胎发育存在调整型发育[2]。尾索动物海鞘由于其卵和幼体透明,结构简单,基因组较小且为单拷贝,并且在进化上是最接近脊椎动物的无脊椎动物,也是人们较早利用开展进化发育生物学研究的模式动物[3]。鉴于海洋生物的经济和科研价值,对其基础及应用研究也在不断深入。

近十年来,随着第二代高通量测序技术的发展,



玻璃海鞘(Ciona intestinalis)[4]、萨氏海鞘Ciona savignyi)[5]、海胆(Strongylocentrotus purpuratus)[6]、住囊虫(Oikopleura dioica)[7]、佛罗里达文昌鱼(Branchiostoma floridae)[8]、牡蛎(Crassostrea gigas)[9]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)[10]、大黄鱼(Larimichthys crocea)[11]、海带(Saccharina japonica)[12]等大量海洋生物的基因组被测定,这为海洋生物学的研究者们提供了比以往更加丰富的遗传基因资源。然而海洋生物普遍存在生长周期长,生活环境复杂的特点,大多难以在实验室条件下长期养殖,仅仅依靠传统的正向遗传学方法进行研究费时费力,已经明显不能满足现实的要求。面对这些庞大的数据,海洋生物学家们需要有更强大的分子生物学工具,特别是基因编辑工具的支持,才能更为有效地利用海洋生物基因资源。CRISPR/Cas9技术是近三年来高速发展的一种基因编辑技术,2013年、2015年先后两次被Science杂志评为当年的十大科学突破,2015年更是位居榜首。CRISPR技术自2013年首次应用于人类细胞后[13—15],已在多个物种中取得成功,成为众多研究者操作基因组的不二选择。本文将从CRISPR/Cas9技术入手,介绍其发展过程及其在海洋生物中的应用现状和前景展望,以期推动这一技术在海洋生物研究中得到广泛应用。

1 基因编辑技术的发展历史与现状

基因编辑技术是反向遗传学的重要研究手段。在反向遗传学的发展过程中,曾经出现了大量的实用技术。早在1979年,Scherer和Davis就利用同源重组的方法编辑了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因,成功构建了删除his3基因的菌株和在染色体XV中插入半乳糖诱导区的菌株[16]。1985年,Smithies等[17]又利用同源重组的方法编辑了人类细胞的基因。20世纪90年代中后期至21世纪初,又相继诞生了RNA干扰[18]、基因敲降技术[19,20],大大加速了分子生物学的研究进程。人工核酸酶技术是最近几年出现的一种全新的基因编辑技术。人工核酸酶是一类人工构建的能识别特定DNA序列并能在DNA分子上形成双链切割(Double strandbreaks,DSB)的核酸酶。受损的DNA通过两种修复机制,既非同源末端连接(Non-homologous endjointing,NHEJ)和同源重组(Homologousrecombination,HR)[21—23]进行修复。在哺乳动物细胞中非同源末端连接是一种重要的易错修复机制,在修复过程中,DNA双链受损部位会插入或缺失部分碱基,当这种插入或缺失处于基因开放阅读框内,并且插入或缺失碱基数不为3或3的倍数时,就会造成开放阅读框的移码突变,使这个开放阅读框的信息不能正确翻译,从而起到基因敲除的作用[24]。而在酿酒酵母细胞中,同源重组则是一种占统治地位的修复机制,二倍体酿酒酵母通过另一条染色体作为提供正确片段的供体来修复受损的DNA,当人工核酸酶的切割发生在单倍体酿酒酵母中时,通过提供人工设计的供体,可实现对单倍体酿酒酵母的定点基因编辑[25]。人工核酸酶技术经过近几年的发展,形成了3种代表性的技术,即锌指核酸酶技术(Zincfingernucleases,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶技术(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)和CRISPR/Cas9技术。

锌指核酸酶,是第一代人工核酸酶技术。锌指蛋白,最早于1985年在非洲爪蟾(Xenopus laevis)的转录因子TFIIIA中发现[26]。1988年Frankel和Pabo将锌指蛋白定义为调节蛋白中的一些依赖锌离子的DNA结合域,这些氨基酸序列富含Cys残基,并通过与锌离子的结合而形成稳定的手指状结构,故名锌指蛋白[27]。通常,每个锌指蛋白结构域可以识别3个碱基,将3—6个锌指蛋白结构域相连即可识别连续的9—18个碱基[28]。约翰霍普金斯大学的Kim等[29]最先将锌指蛋白结构域与限制性核酸内切酶FokⅠ的催化结构域融合,获得了具有新识别特性的核酸内切酶。当2个FokⅠ结构域形成二聚体时,能实现对DNA的双链切割,因此必须在靶点两侧设计2个串联锌指蛋白结构域才能实现对靶点的精确切割。构建锌指核酸酶的主要方法有:Wright等[30]最早使用的模块组装法(Modularassembly, MA)、Sangamo公司的专利技术CompoZr方法以及“锌指联合会”提出的开源在线设计软件ZiFiTTargete(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)等[31]。

类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN),属于第二代人工核酸酶系统,被Science评为2012年的十大科学突破。TALEN技术基于一类来自于植物病原黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)的蛋白TALE蛋白家族,AvrBs3是该家族第一个被发现的成员[32]。TALE蛋白类似于真核生物的转录因子,可以识别特异的DNA序列进而调控宿主植物内源基因的表达[33]。TALE蛋白肽链中部是由1—33个长度约33—35个氨基酸残基的重复单元和C端的长度为20个氨基酸残基的半重复单元构成的DNA识别和结合结构域。重复单元中的+12和+13位置的氨基酸残基是特异识别DNA碱基的关键位点,称为重复可变双残基(Repeatvariablediresidue,RVD)。对应A、T、C、G四种碱基,最常见的RVD序列分别是NI(AsnIle)、NG(AsnGly)、HD(HisAsp)和NN(AsnAsn)。TALE相比锌指蛋白最大的优势是DNA的碱基排列与重复单元有很好的一一对应关系,而不存在锌指蛋白的上下文效应。TALEN技术的DNA切割结构域与ZFN相同,都是FokⅠ,因此TALEN的作用靶点同样需要成对设计。Bogdanove和Voytas[34]提出了TALEN靶位点选择的原则并建立了最早的TALEN网站(https:// talent.cac.cornell.edu/)。上文提到的ZiFiT网站也提供TALEN靶点的设计工具。TALEN技术应用的瓶颈在于重复序列的构建,应用中一般会选择10bp以上的靶点序列,这就至少需要9.5个重复单元,每个重复单元33—35个氨基酸残基,这个重复结构的对应的DNA序列总长将达到近1kb,利用常规方法构建这一重复序列是十分困难的。针对这一重复序列,研究者们提出了GoldenGate、连续克隆组装、固相合成、长粘末端组装、单元组装法等不同的组装策略[34]。

2013年出现的CRISPR/Cas9技术改造自细菌的Ⅱ型CRISPR系统,被称为第三代人工核酸酶。相比ZFN和TALEN技术,CRISPR技术更加简便,在应用中只用到Cas9蛋白和sgRNA两个元件,针对不同的靶点序列只需改变sgRNA上约20nt的识别序列即可。同时,该技术低廉的价格和极高的突变效率,使其出现之后迅速在多种生物中得到成功应用,逐步取代了ZFN和TALEN两种技术。

2 CRISPR/Cas9基因编辑技术

2.1 CRISPR/Cas9系统的发现

CRISPR是Clusteredregularlyinterspacedshort palindromicrepeatsequences的缩写,称为成簇规律间断短回文重复序列。Cas9则是CRISPRassociatedgene9的缩写。CRISPR最早发现于1987年, Ishino等[35]在克隆大肠杆菌K12(Escherichia coli)的iap基因的时候发现,在该基因3′非翻译区中存在5个29个碱基对的重复序列,它们中间则是不重复的32个碱基对的间隔序列,但是文章中并没有描述其具体功能。20世纪90年代,陆续在许多古生菌和细菌中发现了类似的间断重复序列,但是这些序列始终没有统一的名称[36—39]。2000年Mojica等[40]依照这些序列的结构特点,将其命名为短规律间隔重复序列(ShotRegularlySpacedRepeats,SDSRs)。2002年,Jansen等[41]将这种重复序列命名为CRISPR (Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences),指出该基因座由重复的repeat序列和位于其repeat序列中间的spacer序列组成;同时,研究者还在该基因座附近确定了4种Cas基因(CRISPR-associatedgene)的ORF,并将其命名为Cas1-4,其中Cas3预测具有DNA解旋酶的功能,而Cas4预测具有核酸外切酶的功能,但是CRISPR和Cas基因的具体功能当时还未知。同年,Makarova等[42]提出这些ORF和CRISPR基因座可能构成了一种潜在的DNA修复系统。2005年,Haft等[43]通过生物信息学方法确定了45种Cas蛋白家族,其中有1种预测为HNH结构域核酸内切酶的蛋白Csn1即后来被广泛应用的Cas9。Bolitin等[44]发现细菌CRISPR基因座中的spacer区有很多序列来源于噬菌体,并且细菌抵抗噬菌体侵袭的能力与其spacer序列的数量相关。Mojica等[45]也发现,在多种细菌中都有一部分spacer序列来源于细菌以外的病毒、质粒或非染色体成分,在酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)菌株SF370中,甚至有超过90%的Spacer序列来源于噬菌体,这些spacer序列的存在与细菌对抗噬菌体的能力密切相关。2006年,Makarova等[46]提出Cas蛋白和CRISPR基因介导细菌以类似真核细胞RNA干扰的方式对抗侵入的质粒和噬菌体。2007年,Barrangou等[47]发现,细菌通过整合噬菌体基因组中的序列为自身新的spacer序列来获得免疫该种噬菌体的能力,增添或删除spacer序列将改变细菌对某些噬菌体的抗性。2008年,Brouns等[48]发现细菌CRISPR基因座编码的pre-RNA经过Cas蛋白的加工后产生的小crRNA可以介导细菌对病毒的免疫反应。Koonin和Makarova[49]在2009年的综述文章中总结了这一时期的工作,指出CRISPR系统是细菌的一种获得性免疫系统。2009年Hale等[50]研究发现CRISPR系统可以在RNA的指导下切割RNA。2010年,Garneau等[51]发现CRISPR系统通过切割入侵的噬菌体或质粒的DNA来实现对病原的免疫。2011年Deltcheva等[52]发现crRNA的成熟需要细菌体内一种被称为tracrRNA的小RNA介导,并且需要Csn1蛋白(Cas9)和RNA酶III的参与。2011年,Sapranauskas等[53]证实Ⅱ型CRISPR系统仅需要Cas9一种蛋白参与即可完成切割DNA的过程。2012年8月,Jinek等[54]发现Cas9是一种由tracrRNA和crRNA介导的DNA内切酶并提出了将CRISPR改造为基因编辑系统的设想。2013年1月,Cong等[13]和Mali等[15]在Science上同时发表各自的研究成果,首次在真核细胞中利用CRISPR技术实现了基因的定点突变。随后,Jinek等[14]也在eLife上发表文章,验证了其2012年的设想,利用CRISPR在人类细胞中实现了基因的定点敲除。一个属于CRISPR的新时代就此拉开了帷幕(图1)。

2.2 CRISPR系统的分类和作用机制

CRISPR基因座广泛存在于古细菌和细菌中,接近90%的古细菌和超过40%的细菌基因组或质粒中含有至少1个CRISPR基因座[55]。根据构成CRISPR系统的原件不同和crRNA成熟方式的差异,细菌的CRISPR系统可分为三种类型,称为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅱ型系统仅需要Cas9一种蛋白即可完成对外源DNA的双链切割,因此最适合改造成人工核酸酶系统用于基因定点编辑[56,57]。典型的II型CRISPR基因座(CRISPRloucs)结构如下, 5′端是可转录为tracrRNA的区域,中间是包括Cas9在内的多种Cas蛋白的ORF区域,靠近3′端则是CRISPR重复间隔区域(CRISPRrepeat-spacer array)。整个CRISPR重复间隔区域由一段引导序列(Leadersequence)引导,其下游是间隔分布的重复序列(Repeat),以及位于重复序列之间的间隔序列(Spacer),间隔序列起源于曾经侵入的噬菌体或质粒[56—59]。

图1CRISPR技术的发现简史(参考Hsu,et al.,2014)Fig.1MilestonestudiesinthediscoveryofCRISPR/Cas9techniqueforgenomeeditingandengineering

Ⅱ型CRISPR系统在细菌体内作用过程可以分为三个阶段(图2)。第一阶段是间隔序列的摄取。当噬菌体首次入侵时,Cas蛋白识别噬菌体中的原型间隔序列临近基序(ProtospacerAdjacentMotif Sequence,PAMSequence),并将噬菌体DNA裂解后的片段整合到宿主细菌的基因组的CRISPR基因座的间隔序列(Spacer)区域中。第二阶段是crRNA和tracrRNA共同成熟及Cas9切割复合体的形成。在这一阶段转录形成的前crRNA(Pre-crRNA)和未成熟的tracrRNA有部分片段以碱基互补的方式结合形成双链RNA区域,同时Cas9蛋白会识别tracrRNA的茎环结构并与之结合,随后RNA酶Ⅲ对双链RNA区域进行切割,完成Pre-crRNA和tracrRNA的共同成熟,成熟的crRNA、tracrRNA和Cas9形成稳定的Cas9切割复合体。第三阶段是Cas9切割复合体对外源DNA的切割。在这一阶段,crRNA会识别外源DNA中的一条链,以碱基互补的方式与之结合,位于Cas9蛋白N端的RuvC核酸酶结构域和位于蛋白肽链中部的HNH核酸酶结构域分别结合DNA的双链并完成对DNA的双链切割(Doublestrand breaks,DSBs)形成平末端。被切割的DNA在细菌体内降解,完成细菌对噬菌体的免疫过程[52,54,58]。

2.3 CRISPR技术的应用

CRISPR在基因敲除中的应用通过将细菌CRISPR系统的元件导入真核细胞,可以在真核细胞的基因的特定位置上形成双链切割,进而激活修复机制,实现基因的定点敲除。在细菌中Ⅱ型CRISPR系统的必备元件包括crRNA、Cas9蛋白、tracrRNA三种成分,同时在crRNA的加工过程中还需要RNaseⅢ的参与[52]。而在真核细胞中,并不存在天然的pre-crRNA,只需导入成熟的crRNA即可,因此不需要RNA酶Ⅲ的参与。2013年,Cong等[13]的研究也证实了这一点,同时该研究还发现人工设计的crRNA的靶点在位于其PAM序列上游至少13个碱基以内的范围内不能存在任何点突变,否则将造成crRNA无法识别靶点而使基因敲除失败,该研究首次成功利用CRISPR技术敲除了人类细胞的基因。Jinek等[54]在研究细菌CRISPR系统时发现人工合成的引导RNA(guideRNA,gRNA某些研究中也称为singleguideRNA,sgRNA)代替tracrRNA和crRNA可以取得类似的结果。Jinek等[14]随后在其利用CRISPR敲除人类细胞基因的研究中,也采取了合成gRNA的策略。2013年,Mali等[15]在其研究中,利用人工设计的gRNA,取得了与Cong等相似的实验结果。这些研究,为CRISPR系统在真核细胞中广泛应用奠定了基础。现在对于真核生物,只需利用CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)等软件(该软件提供了超过200种生物的基因组信息,用于排除gRNA设计过程中潜在的脱靶位点)针对靶基因设计的特异性的gRNA,选择合适的转基因方法将gRNA(或表达gRNA的质粒)和表达重组Cas9蛋白的质粒(或mRNA)导入到细胞内即可实现对靶基因的定点敲除(图3)。

斑马鱼(Danio rerio)是第一种成功利用CRISPR技术进行基因敲除的脊椎动物,2013年Hwang等[60]利用CRISPR技术尝试敲除斑马鱼胚胎中的10个基因,其中8个获得了较高的突变效率。目前利用CRISPR技术已经在人类体外培养细胞[13—15]、小鼠细胞[13]、斑马鱼[60]、小鼠(Mus musculus)[61]、大鼠(Rattus norvegicus)[62]、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)[63]、果蝇(Drosophila melanogaster)[64]、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)[65]、水稻(Oryza sativa)[66]、小麦(Triticum aestivum)[66]、拟南芥(Arabidopsis thaliana)[67]、烟草(Nicotiana benthamiana)[67]、家蚕(Bombyx mori)[68]、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)[69]等多种物种中实现了基因定点敲除。

图2细菌CRISPR基因座的作用机制Fig.2ThemechanismsofCRISPRlociinBacteria第1阶段.噬菌体DNA序列插入CRISPR基因座(CRISPRlocus)的间隔序列(Spacer)中。第2阶段.pre-crRNA和tracrRNA的共同成熟与Cas9复合体的形成。第3阶段.Cas9切割复合体对侵入的噬菌体DNA进行切割。蓝色虚框仅标明不同阶段,不表示任何细胞结构(参考DoudnaandCharpentier,2014;Hsu,et al.,2014;Wiedenheft,et al.,2012;李君等,2013)Stage1.GenomeDNAofbacteriophageisinsertedintothespacersequenceoftheCRISPRloci.Stage2.pre-crRNAandtracrRNAcomaturationandCas9cleavagecomplexformation.Stage3.BacteriophageDNAiscutbyCas9cleavagecomplex.Bluedashgridlinesmark thedifferentworkingstages.Theydonotindicateanycellstructure

图3CRISPR用于基因敲除的原理Fig.3TheproceduresandprincipleofCRISPRforgeneknockoutA.经过共同成熟过程后形成的的crRNA:tracrRNA复合体示意图。B.通过在crRNA和tracrRNA之间添加连接序列(图中紫色部分)形成的引导RNA(guideRNA,gRNA)示意图。C.利用CRISPR系统在真核细胞中进行基因敲除的一般方法示意图。表达gRNA的质粒和表达Cas9的质粒通过转染、电穿孔、显微注射等转基因方法进入细胞后,在细胞内经过转录、翻译等过程后形成gRNA和Cas9蛋白的复合体,识别特异的DNA序列并完成切割,随后激活DNA修复机制,修复过程产生移码突变,造成基因敲除的效果(参考Jinek,et al., 2013;Stolfi,et al.,2014)A.SchematicofcrRNA:tracrRNAcomplexafterco-maturation.B.SchematicofgRNAthatformedbyaddingalinker-sequence(thepurple part)betweencrRNAandtracrRNA.C.ProceduresofgeneknockoutviaCRISPRsystem.PlasmidsthatexpressgRNAandCas9 respectivelyenterthecellbytransfection,electroporationandmicroinjection.Cas9andgRNAformacomplexthatrecognizesandcutsthe specificDNAsequenceincell.DNAbreakswillinduceitsrepairmechanismatthesiteofdamage.Thus,DNAwillbeeditedthrough codingframeshiftinthisprocess

CRISPR在基因编辑中的应用Cas9在目标DNA上产生双链切割(DSB)后,会激活机体的修复机制。针对不同的修复机制,有不同的方法实现基因编辑。如果DNA以非同源末端连接的方式进行修复,可以添加两端为平末端的DNA供体,在修复过程中有一定几率形成供体与破损末端的连接,从而实现基因编辑[70]。但是这种情况效率很低,不能保证插入的方向,而且非同源末端连接是一种易错修复机制,修复过程中可能会产生碱基的插入或缺失。如果细胞以同源重组的方式修复,需要添加两端含有与破损末端的同源序列的DNA供体,通过同源重组将供体与破损基因组整合,以实现定点编辑[70]。这种方式更为精确,但是某些物种因为同源重组不是主要的修复方式而造成无法使用这种方法(图4)。在酿酒酵母中同源重组是最主要的修复方式,适合以这种方式进行基因编辑。Jakounas等[25]在酿酒酵母中的研究证明,通过一次转入可以表达多个gRNA的质粒,可以在酿酒酵母中利用CRISPR系统一次编辑同一代谢通路中的多个基因。Chang等[71]在斑马鱼中借助mloxP重组系统,成功在CRISPR系统产生的切口处插入了目的DNA片段。Li等[72]利用CRISPR技术建立了斑马鱼的基因敲入模型,成功标记了斑马鱼神经元。Wagner等[73]利用CRISPR技术和同源重组的原理成功编辑了恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的基因组,使其破坏红细胞的能力下降。

利用Cas9失活突变体dCas9的应用对Cas9蛋白结构的研究表明,Cas9有两个重要的DNA切割结构域——RuvC核酸酶结构域和HNH结构域。位于N端的RuvC核酸酶结构域切割与gRNA序列相同的DNA链,而位于肽链中部的HNH结构域则切割与gRNA互补结合的DNA链的。如果将位于肽链第10位的天冬氨酸突变为丙氨酸(突变体D10A)将造成RuvC结构域失活,如果840位的组氨酸突变为丙氨酸(突变体H840A)将造成HNH结构域失活,这2种突变体将都只能进行单链切割。如果突变体同时具有上述2种突变D10A和H840A,则该突变体将丧失切割双链的能力,而只保留结合gRNA并识别靶基因的能力,这种突变体被称为dCas9[74,75]。

dCas9可用于调控基因的表达。Qi等[75]在基因编码区的上游区域设计一系列sgRNA识别位点,利用dCas9蛋白与之结合,利用空间位阻阻断目标基因的转录,实现基因敲降,这种技术被称为CRISPRi。Perez-Pinera等[76]的研究发现,将可以激活转录的VP64结构域与dCas9蛋白构建为融合蛋白, dCas9-VP64融合蛋白可在sgRNA的介导下结合在目标基因编码区上游的调控区域,进而激活目标基因的转录,激活的强度与上游结合的sgRNA数量存在一定的相关性。Zalatan等[77]在利用dCas9调控基因表达方面则另辟蹊径,在其研究中,dCas9本身并不偶联任何激活或抑制基因转录的结构域,而是在sgRNA3′末端偶联上重新设计的2种不同的RNA折叠区域,利用这段新的RNA折叠区域分别识别并结合转录激活结构域VP64和转录抑制结构域KRAB,从而激活或抑制酿酒酵母内相应基因的表达。

通过在dCas9蛋白上偶联不同的接头,还可以利用CRISPR系统对基因组进行一些特殊操作。如将荧光蛋白偶联到dCas9上,可利用其来构建探针以识别特定的核酸序列。Ma等[78]在研究中成功使用了3种来自不同细菌的识别不同PAMsequence的dCas9蛋白来标记同一染色体的不同区域。又如,将乙酰转移酶偶联到dCas9上,可利用其进行表观基因组编辑。Hilton等[79]将人类的乙酰转移酶p300偶联到dCas9上,通过加强靶基因组蛋白的乙酰化来增强基因的表达水平。

图4不同DNA修复机制下的基因编辑方法(参考GillesandAverof,2014)Fig.4MethodsofgeneeditingunderthedifferentmechanismsofDNArepair

CRISPR在医药方面的应用CRISPR技术可用于快速的构建疾病的动物模型。利用传统的方式构建疾病动物模型耗时较长,而利用CRISPR系统,仅需一代时间,就能获得转基因小鼠[61]。麻省理工学院的Xue等[80]利用尾静脉注射的方式,将CRISPR系统导入成年小鼠肝脏内,成功敲除了其P53和Pten这两个重要的抑癌基因,使得成年小鼠肝脏发生了肿瘤。Platt等[81]则利用慢病毒载体将Cas9整合到小鼠的基因组上,再利用慢病毒将包含有P53、Lkb1、Kras基因靶点的sgRNA送入小鼠体内,成功诱发了小鼠的肺癌,建立了小鼠的肺癌模型。

CRISPR技术在医药方面的另一个重要应用是用于基因治疗。许多人类遗传病是单一基因的缺陷造成的,如在我国南方地区发病率较高的地中海贫血症,是由于珠蛋白缺失或点突变造成的。2014年,Xie等[82]为利用CRISPR基因治疗地中海贫血迈出了重要一步,在该项研究中,研究者们利用地中海贫血患者的皮肤细胞诱导产生iPSC,并利用CRISPR技术结合piggyBac转座子修复了有缺陷的珠蛋白基因,随后诱导iPSC分化形成可以稳定表达正常珠蛋白的红细胞。2015年4月,中山大学的黄军就[83]课题组首次尝试利用CRISPR技术修复了人类三核胚胎中的地中海贫血相关基因,获得了一定的成功。运用CRISPR技术进行基因治疗的另一个热点是艾滋病。治疗的思路源于世界上第一例被治愈的艾滋病患者“柏林病人”,该患者同时患有艾滋病和白血病,在其接受白血病治疗过程中接受了骨髓移植,骨髓供体的造血干细胞恰好带有一种罕见的被称为delta32的突变,该突变可以使CCR5受体发生改变而使HIV不能进入T细胞中,患者因骨髓移植同时治愈了白血病和艾滋病。根据这一思路,可以提取患者自身的造血干细胞,使用CRISPR技术改变其CCR5受体,在重新移植进患者体内,使HIV不能侵袭改造过的T细胞,但是目前该方法还停留在基础研究阶段,未进行任何临床试验[84—86]。Hua等[87]选择了一种直接利用CRISPR技术清除病毒的策略,他们针对HIV-1的LTRU3区域设计sgRNA,直接切除那些已经整合到感染者基因组上的病毒DNA,从而抑制病毒复制,但该方法能否彻底清除数量众多的被感染细胞中的病毒DNA还有待验证。

3 CRISPR技术在海洋生物中应用的现状

目前,CRISPR系统在海洋生物中应用的报道还比较少,最早公开的报道见于2014年,Sasaki等[88]首先在玻璃海鞘中利用CRISPR技术实现了基因定点敲除。在该研究中,作者针对玻璃海鞘的Hox3、Hox5、Hox12共选择了8个长度为20个碱基的靶点,并构建了相应的sgRNA表达框架;随后利用电穿孔方式将这些表达框架分别导入玻璃海鞘的受精卵中,一同导入的还有表达Cas9蛋白的mRNA;结果显示,有6个sgRNA框架未能发挥作用,针对Hox3的1个sgRNA框架和Hox5的1个sgRNA框架使目标基因产生了突变。该研究还确定,导入的sgRNA表达框架质量必须大于1.5pg,表达Cas9蛋白mRNA的质量必须大于15pg,系统才能在玻璃海鞘受精卵中产生相应突变,突变率随着注射量的增加而增加。同年Stolfi等[89]也成功的利用CRISPR系统在玻璃海鞘中实现了基因定点突变。Stolfi等[89]等选择的靶基因是在发育过程中决定细胞命运的ebf基因,共构建了2个gRNA表达载体,利用电穿孔技术分别将这2个载体同Cas9蛋白表达质粒导入玻璃海鞘受精卵中,取得了较高的突变效率。同时针对gRNA表达载体在玻璃海鞘体内转录提前终止的问题,事先对载体上的部分序列进行了改造,以帮助这些质粒在细胞中顺利转录。最近,该研究组发展了新简化的Cas9构建方法,并构建了玻璃海鞘引导RNA数据库,用于系统的玻璃海鞘功能基因的敲除[90]。Ikmi等[91]利用分别用CRISPR技术和TALEN技术对海葵(Nematostella vectensis)的NvFP-7R进行了敲除, NvFP-7R是一种内源的红色荧光蛋白,经过基因敲除的海葵不能发出红色荧光,该研究还证明了NvFP-7R并不是海葵发育所必须的。Perry和Henry[92]则尝试利用CRISPR技术对大西洋角螺(Crepidula fornicata)的β-catenin基因进行编辑,成功在其CDS的3′端添加了一段编码荧光蛋白mCherry的序列,在大西洋角螺幼虫中可以检测到具有红色荧光信号的β-catenin蛋白。Square等[93]利用CRISPR技术对海七鳃鳗(Petromyzon marinus)进行研究,研究者将Cas9的mRNA和针对TYR基因设计的gRNA注射进受精卵中,成功对TYR基因进行了敲除。Lin和Su[94]利用显微注射技术将表达Cas9蛋白的mRNA和针对spNodal基因设计的sgRNA注入到海胆的受精卵中,成功敲除了海胆的spNodal基因,在该研究中作者针对spNodal基因的2个外显子分别设计了3种gRNA,在全部6种gRNA中有5种获得了较好的敲除效果,产生了预期的放射状表型。Martin等[95]用CRISPR技术在海洋甲壳端足类动物中成功实现了对HOX基因的定点敲除。Nymark等[96]将CRISPR技术的应用领域拓展到了海洋藻类中,他们利用CRISPR技术成功敲除了三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的CpSRP54基因。

在海洋经济生物有关的研究中,目前仅见2篇相关报道。Edvardsen等[97]在研究大西洋鲑(Salmo salar)身体着色过程中的关键基因slc45a2和tyr过程中,利用CRISPR技术对其进行了敲除,针对每个基因分别设计的3种sgRNA均不同程度的导致了大西洋鲑的幼体体色变浅,证明了CRISPR系统确实可以在大西洋鲑体内发挥作用。最近,研究人员利用CRISPR/Cas9技术在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)中成功实现了几丁质酶基因EcChi4的敲除,并观察了EcChi4敲除对脊尾白虾生长发育的影响[98]。

4 CRISPR技术在海洋生物中的应用前景展望

现今制约CRISPR技术在海洋生物中开展的主要因素是多数海洋生物缺少成熟稳定的转基因技术。因此建立成熟的转基因方法是实现CRISPR技术在海洋生物中大规模应用的先决条件。一旦解决转基因方法的问题,可以尝试进行Cas9蛋白稳定表达转基因海洋生物品系的构建,这将大大推动CRISPR技术在海洋生物中的应用。目前在果蝇研究中,有研究者[24]通过转基因手段将表达Cas9蛋白的基因片段整合到果蝇基因组中,当需要利用CRISPR进行基因敲除时,只需将gRNA的表达载体导入转基因果蝇卵中,即可完成定点突变,该方法可以大大提高了基因敲除的效率。Platt等[81]也成功构建了稳定表达Cas9的转基因小鼠,用于快速构建癌症小鼠模型。

在海洋动物的CRISPR技术应用中,还有一个值得探索的方向是光遗传学与CRISPR技术的结合。光遗传学,就是结合生物工程方法,利用光对某些生物活动进行控制。在CRISPR的研究中,可以利用光控元件与Cas9蛋白的偶联,在时间和空间上实现对CRISPR系统的进行控制。Nihongaki等[99]将正常的Cas9蛋白分成2部分,分别偶联上不同的光控元件,该光控元件源自粗糙脉胞菌(Neurospora crassa),存在带正电与带负电的两种形式,黑暗状态下以单体形式存在,在蓝光作用下能形成异源二聚体从而使与之偶联的被分割为2部分的Cas9蛋白重新聚合成一个完整蛋白。在Nihongaki等[100]的另一项研究中,则利用失去双链切割能力的Cas9突变体dCas9偶联光控元件CIB1,该融合蛋白与gRNA形成复合体识别并结合靶DNA,在蓝光作用下,偶联了光控元件CYB2的激活因子可以与上述复合体结合,从而激活靶基因的表达。Polsein和Gersbach[101]在研究中也使用了类似的方法,所不同的是,他们所使用的Cas9偶联了2个CIBN结构域,效率较只偶联1个结构域更高。上述光遗传学技术如果用于海洋动物中,就能方便的利用光控制基因的时空表达模式,将有助于发育生物学研究。

CRISPR另一个极具潜力的应用方向是海洋动物遗传育种。2015年美国FDA批准了转基因三文鱼上市销售,成为首例获准上市的转基因动物[102]。基因工程手段用于遗传育种正逐渐被消费者认可。Qian等[103]在2015年的一项研究中利用锌指核酸酶技术敲除了家猪(Susscrofa domestica)体内抑制肌肉生长的mstn基因,获得了肌肉含量更加丰富的家猪品种。CRISPR技术比锌指核酸酶技术更加简便、快捷、廉价。目前CRISPR技术在海洋经济鱼类大西洋鲑[97]和淡水鱼类斑马鱼[60,71,72]和青鳉(Oryzias latipes)[104]中均取得了成功。如果在水产领域应用推广此项技术,敲除鱼、虾、贝类的肌肉抑制基因,获取更高肌肉含量的水产品种将具有十分广阔的市场前景。

目前,利用CRISPR技术在几乎所有的模式生物中实现基因的定点敲除和编辑,在海洋生物中也已有9种生物,即玻璃海鞘[88—90]、海胆[94]、海葵[91]、大西洋角螺[92]、海七鳃鳗[93]、大西洋鲑[97]、端足类动物[95]、脊尾白虾[98]、三角褐指藻[96]中获得了成功,涵盖了尾索动物、棘皮动物、刺胞动物、贝类、圆口纲、鱼类、甲壳动物和藻类等8个生物类群。相信不远的将来,随着人们认识的进一步的深入,CRISPR技术一定可以在更多的海洋生物体内实现基因编辑,帮助研究者们获得更多、更有价值的研究成果。

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CRISPR/CAS9 AND ITS APPLICATIONS IN MARINE ORGANISMS

LIXiang1andDONGBo1,2,3
(1.College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao266003,China;2.Institute of Evolution & Marine Biodiversity,Ocean University of China,Qingdao266003,China;3.Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao266100,China)

CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences)isanadaptiveimmunesystem thatconfersresistancetobacteriophageorexogenousplasmidinbacteria.CRISPR/Cas9technologydevelopedfrom bacterialtypeIICRISPRsystemhasbecomeapowerfulgenomiceditingtoolsuccessfullyusedinmostofexisting creatures.ComparedwithZinc-fingernucleases(ZFN)andTranscriptionactivatorlikeeffectornucleases(TALEN) techniques,theadvantagesofCRISPR/Cas9technicalsystemaremoresimple,highlyefficient,andcheaper.Butfor marineorganisms,itisnotwidelyusedbecauseofthedifficultyoftransferringexogenousDNAintomostofmarine animals.Inthisreview,weintroducedthedevelopmentalcourse,workingmechanisms,prospectsofCRISPR/Cas9 technologyandthecurrentstatusofitsapplicationinmarineorganisms.Moreover,weanalyzedthepotentialapplicationofdCas9andthecombinationofCas9andoptogeneticcontrolmethodonstudyinggeneregulatorymechanismsin marineanimals,whichmightpromotefurtherapplicationofCRISPR/Cas9technologyinmoremarineorganismsinthe nearfuture.

CRISPR/Cas9;Geneediting;Marineorganisms;Functionidentification;Generesources



10.7541/2017.31

Q789

A

1000-3207(2017)01-0244-13

2016-03-23;

2016-06-17

国家自然科学基金(31572352);山东省自然科学基金(ZR2015DM003);山东省泰山学者建设工程专项经费资助[Supportedby theNationalNaturalScienceFoundationofChina(31572352);theNaturalScienceFoundationofShandongProvince (ZR2015DM003);TaishanScholarProgramofShandongProvince]

李响(1986—),男,天津市人;博士研究生;主要从事动物基因组编辑技术的研究。E-mail:lx861024@126.com

董波,男,辽宁丹东人;博士,教授;主要从事动物胚胎发育与器官形态发生方面的研究。E-mail:bodong@ouc.edu.cn