金线莲中槲皮素的超声提取及HPLC法测定

陈吓俤+谢淑芳+郑小珍+郑婉萍+林雅玲+郑秋虹

摘要：以金线莲（Anoectochilus roxburghii）为研究对象，采用超声波法提取，用高效液相色谱法测定了金线莲中槲皮素的含量。在单因素试验基础上，对乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率4个因素进行了4因素3水平的正交试验。结果表明，槲皮素在0.000 5～0.010 0 mg/mL范围内呈良好线性关系，加样回收率为84.61%～85.90%。金线莲中槲皮素的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数80%、料液比1∶25 （g∶mL）、超声功率420 W、超声时间30 min。在此工艺条件下，金线莲中槲皮素的提取率为0.011 0%。试验对金线莲中有效成分含量的测定具有参考价值。

关键词：金线莲（Anoectochilus roxburghii）；超声提取；槲皮素；高效液相色谱法

中图分类号：S567.23+9；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5324-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.039

Abstract： Quercetin in Anoectochilus roxburghii was ultrasonically extracted and detected by HPLC. On the basis of single-factor experiment， an orthogonal test designed for the four factors including ethanol concentration， material-liquid ratio， ultrasonic time， ultrasonic power， and three levels was carried out. Results showed that the calibration curve of quercetin was well linear in the range of 0.000 5～0.010 0 mg/mL. The recovery was from 84.61% to 85.90%. The optimum extraction was carried out in 80%（V/V） ethanol for 30 min with the ultrasonic power of 420 W，and the material-liquid ratio of 1∶25（g∶mL）. Under the technical conditions， the extraction yield of quercetin in Anoectochilus roxburghii was 0.011 0%. The experiment could provide valuable reference for the content determination of effective components in Anoectochilus roxburghii.

Key words： Anoectochilus roxburghii； ultrasonic extraction； quercetin； HPLC

金线莲（Anoectochilus roxburghii）是兰科开唇兰属（Anoectochilus）的一种多年生草本植物，国家二级保护植物[1-3]。金线莲的主要成分为甾醇、萜类、生物碱、多糖、黄酮类等，具有清热解毒、消炎止痛、镇咳和治糖尿病等功效[4，5]。槲皮素是黄酮类化合物中的一种，具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗菌、抗病毒、抗癌等作用。中草药中槲皮素的测定方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、示波极谱法、荧光光度法、紫外分光光度法、薄层扫描光度法、伏安法等方法测定[6-9]。

本试验以金线莲为原料，采用超声波辅助提取法提取金线莲中的槲皮素，以乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率为因素，通过单因素和正交试验确定最佳提取工艺，旨在为金线莲的进一步开发利用提供理论支撑和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

金线莲购自福建省金草生物科技有限公司。

1.2 仪器与试剂

高效液相色谱仪（美国安捷伦有限公司）；植物粉碎机（浙江武义屹立工具有限公司）；循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；超声波清洗仪（昆山市超声仪器公司）。

槲皮素、乙腈、乙醇均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；甲醇、石油醚均为分析纯，购于温州市华侨化学试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 C18色谱柱（Agilent ZORBAX SB-C-18，5 μm，4.6 mm×150 mm），流动相为水-乙腈（70∶30～10∶90，V∶V），梯度淋洗，初始流动相为70∶30运行5 min，20 min内升至10∶90，并平衡5 min，流速为1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量20 μL。

1.3.2 绘制标准曲线 配制槲皮素1 mg/mL标准溶液，再配成0.005、0.020、0.040、0.060、0.080、0.100 mg/mL浓度梯度溶液，稀释10倍后，过0.45 μm滤膜，进液相测峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制槲皮素的标准曲线。

1.3.3 金线莲中槲皮素的提取 称取1 g脱脂金线莲粉末，料液比（1∶10～1∶30）（g∶mL，下同）加入50%～90%乙醇溶液，超聲功率设为240～480 W，超声10～30 min后，参照“1.3.2”，筛选出最优的单因素。

1.3.4 正交试验 在“1.3.3”的基础上，对乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率4因素作L9（34）正交设计，因素与水平见表1。

2 結果与分析

2.1 色谱分析

标准品和样品提取液中槲皮素色谱如图1和图2。在该条件下，槲皮素分离度良好。

2.2 单因素试验结果

单因素试验结果见图3至图6。由图3可知，乙醇体积分数为80%时，提取率最大，随着体积分数地增大，提取率反而呈下降趋势。由图4可知，料液比为1∶20时，槲皮素的提取率最大，随着溶剂逐渐增加，提取率反而有下降趋势。由图5可知，随着超声时间的增加，槲皮素提取率也逐渐提高；超声时间30 min时，槲皮素的提取率最大；随着超声时间逐渐增加，提取率反而有下降趋势。由图6可知，随着超声功率地增加，槲皮素提取率也逐渐提高；超声功率为360 W时，槲皮素的提取率最大；随着超声功率逐渐增大，提取率反而下降。

2.3 正交试验结果

在单因素试验的基础上，设计乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率的4因素3水平正交试验，正交试验结果见表2。由表2可知，最佳提取工艺为A2B3C2D3，即乙醇体积分数80%，料液比1∶25，超声功率420 W，超声时间30 min。在此条件下金线莲中的槲皮素提取率为0.011 0%。

2.4 方法评价

1）精密度。取标准品槲皮素溶液20 μL，重复进样6次，其峰面积RSD为0.32%

2）稳定性。分别于0、1、2、3、4、5 h后精密吸取20 μL标准品槲皮素溶液，进HPLC分析。测得槲皮素峰面积RSD为1.09%。

3）重复性。平行制备6份金线莲溶液，依次进液相分析，测得槲皮素峰面积RSD为1.25%。

4）回收率。取已知浓度的金线莲溶液0.5 mL，加入0.5 mg/mL的槲皮素标准溶液0.5 mL，超声混匀，进样20 μL，平行测定6次，测得平均回收率为85.21%，RSD为0.70%

3 结论

金线莲中槲皮素在0.000 5～0.010 0 mg/mL范围内呈良好线性关系，该法仪器精密度良好，稳定性良好，重复性较好，加样平均回收率为85.21%，RSD为0.70%<5%，说明该方法准确度较好。从正交试验结果可得出，最优工艺条件为乙醇体积分数80%、料液比1∶25、超声功率420 W、超声时间30 min。该组合下槲皮素的提取率为0.011 0%。该法可为金线莲中有效成分的测定及药材真伪辨别提供参考。

参考文献：

[1] 鲁成巍，冉景丞.金线莲研究进展及保护利用研究[J].农技服务，2010，27（8）：1040-1042.

[2] 钟岑生.金线莲的药用价值与开发[J].广西农业科学，1997（2）：102-104.

[3] 郑维锋，刘知远.HPLC法测定金线莲中芦丁的含量[J].中国药师，2014，17（9）：1584-1585.

[4] 罗晓青，吴明开，查兰松，等.贵州药用植物野生金线莲资源调查[J].西南农业学报，2011，24（2）：826-828.

[5] 龚秀会，许 敏，董鸿竹，等.不同基原金线莲植物的化学成分比较研究[J].安徽农业科学，2012，40（36）：17530-17531，17607.

[6] 薛 珺，李凤仪.中草药中槲皮素测定方法的研究[J].江西化工，2006（4）：9-14.

[7] 吴水华.荧光分光光度法测定福建野生金线莲中总黄酮含量[J].中国现代中药，2012，14（8）：10-13.

[8] 吴佳溶.不同地理种源金线莲有效成分含量测定SRAP标记[D].福州：福建农林大学，2012.

[9] 惠秋沙.槲皮素及其糖苷的提取和含量测定方法概述[J].药学服务与研究，2011，11（4）：294-296.