链霉菌Streptomycessp.FJS31-2产卤化二型聚酮类化合物的发酵条件优化

王荫荫，王 苗，钱声艳，吕玉红，保玉心，胡永林，岳昌武*

（1.遵义市第一人民医院遵义市基因遗传病精准诊断及药物靶向治疗重点实验室，贵州遵义563003；2.遵义医学院第三附属医院中心实验室，贵州遵义563003；3.遵义医学院微生物资源及药物开发特色重点实验室，贵州遵义563003；4.遵义医学院检验系，贵州遵义563003）

链霉菌Streptomycessp.FJS31-2产卤化二型聚酮类化合物的发酵条件优化

王荫荫1,2,3，王 苗3，钱声艳3，吕玉红3，保玉心3，胡永林4，岳昌武1,2,3*

（1.遵义市第一人民医院遵义市基因遗传病精准诊断及药物靶向治疗重点实验室，贵州遵义563003；2.遵义医学院第三附属医院中心实验室，贵州遵义563003；3.遵义医学院微生物资源及药物开发特色重点实验室，贵州遵义563003；4.遵义医学院检验系，贵州遵义563003）

以产zunyimycin A及BE-24566B类卤化天然化合物的Streptomycessp.FJS31-2为研究对象，分别利用高分辨质谱（HRMS）和高效液相色谱（HPLC）为检测手段，对不同的碳源、氮源组合的培养基在不同的培养时间和萃取条件下获得的目标化合物进行定性和产量的分析。在基础培养基内添加10 g/L无水乙醇浸泡24 h后的腐殖酸，培养17 d，采取乙酸乙酯萃取可以使目标化合物产量提高。

链霉菌；zunyimycin A；发酵条件；优化

人们已分离到约4 500个结构复杂多样的天然卤化物，对于大部分微生物天然产物而言，卤化后其生物活性会发生很大的改变，往往具有较好的生物活性和临床应用潜力[1-2]，如土壤链霉菌来源的卤化产物BE-19412A及其甲基化修饰后的BE-19412B都表现出很好的抗肿瘤活性[3]。目前临床应用的绝大部分卤化抗生素都是来自微生物或其骨架经人工修饰的半合成产物，且化合物主骨架上卤化取代位置及取代基的种类和数目对抗生素的生物活性有不同程度的影响[4-5]。目前临床广泛使用的卤化抗生素大部分是微生物天然产物或其人工修饰的半合成天然产物，近年来新开发的抗生素中，卤化天然产物依然占据重要地位，如2014年美国食品和药物管理局（food and drug administration，FDA）批准上市的用于治疗耐药菌感染的4种新型抗生素中达巴万星（dalbavancin）、奥利万星（oritavanci）、磷酸泰地唑胺（tedizolid）3种抗生素为卤化物[6]。随着在普通生境分离的放线菌中发现新卤化抗生素越来越困难，人们开始把目光转向特殊生境或典型生境，并在沙漠、海洋、植物内生菌等特殊生境中发现了新卤化活性天然产物[7-9]。目前已在不同来源的链霉菌中分离到的二型聚酮类化合物Anthrabenzoxocinones家族成员见图1。Anthrabenzoxcinone家族成员主要包括（+）-anthrabenzoxocinone（又名（+）-ABX、BE-24566B26或1.264C等）以及其结构类似物(-)-anthrabenzoxocinone（-）-ABX，1a)、（-）-bischloroanthrabenzoxocinone（（-）-BABX，1b）和zunyimycin等[10-12]。其中，zuunyimycin A为本课题组首次从链霉菌Stre-ptomycessp.FJS31-2发酵产物中分离获得的一个新卤化二型聚酮化合物，受限于该菌在原始培养基中发酵产率较低，zunyimycin A和BE-24566B及衍生物的活性分析和活性分子机制的解析进展缓慢。

图1 zunyimycin A及结构类似物Fig.1 Zunyimycins and its structural analogue A

本研究通过优化Streptomycessp.FJS31-2发酵培养基组成、培养时间等条件，提高zunyimycin类化合物的产量，为其后续研究以及相关链霉菌天然产物的开发提供物质基础和技术积累。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

链霉菌Streptomycessp.FJS31-2：由本实验室分离自贵州梵净山土壤（海拔高度800 m,东经108°47′50″，北纬27°56′32″），保存于中国普通菌种保存中心（菌株号CGMCC4.7321），该菌已由本课题组进行基因组测序（no.PRJNA320463）。

1.1.2 主要试剂

甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：迈瑞达（北京）公司；微量元素预混液：ZnSO4·7H2O 2 g，FeSO4·7H2O 2 g，MnCl2·4H2O 2 g，CuSO4·5H2O 2 g，Na2B4O7·10H2O 2 g，（NH4)6MO7O24·4H2O 2 g，定容至1 000 mL；腐殖酸A为双蒸水浸泡24 h过滤取滤液，腐殖酸B为无水乙醇浸泡24 h过滤取滤液。

1.1.3 培养基

基础培养基：碳酸钙2 g/L，葡萄糖4 g/L，麦芽抽提物10 g/L，酵母粉4 g/L，琼脂粉18 g/L（液体培养基不含琼脂粉），微量元素预混液0.05%，天然pH值，双蒸水定容至1 L，分装于250 mL（装100 mL）或500 mL三角瓶（装200 mL），121℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

Winpat-WP-30L自动灭菌发酵罐：美国Major Science公司；STRIKE300旋转蒸发仪：意大利Steroglass公司；LC-20A高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）：日本岛津公司；JJ-CJ-2FD双人超净台：苏州市金净净化设备有限公司；BSP-400生化培养箱、YXQ-LS-75SII立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司；Milli-Q Reference超纯水机：德国Merck Millipore公司；DZ-900双层大容量落地式振荡器：苏州培英实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养

菌种活化：取出斜面保存的Strepotomycessp.FJS31-2菌种，接种环刮取菌体接种到基础培养基上28℃培养，挑取单菌落培养至第三代可放大培养。

1.3.2 发酵培养基成分优化

课题组前期对培养基种类进行筛选，确定出基础培养基所产目标化合物比较稳定但含量较低。在此基础上，试通过调整碳源、氮源比例及添加腐殖酸提高代谢产物的产量。设计23种培养基（见表1）用于Strepotomyces.sp. FJS31-2发酵条件优化，每种培养基发酵400 mL，在接种量相同相同培养条件下培养15 d，乙酸乙酯等体积摇床萃取2次、140 r/min振荡12 h，HPLC检测发酵产物中目标化合物紫外吸收峰值及峰面积，并与10号基础培养基做对照，比较不同培养基对化合物产量的影响。

表1 23种发酵培养基的组分Table 1 Components of 23 kinds of fermentation media g/L

1.3.3 培养时间优化

菌体培养至7 d、9 d、11 d、13 d、15 d、17 d、19 d、21 d，200 mL乙酸乙酯等体积摇床萃取2次，140 r/min振荡12 h，HPLC检测zunyimycin A峰面积变化，确定最佳培养时间。

1.3.4 萃取剂优化

采用极性由小到大的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇等体积萃取200 mL，HPLC检测目标化合物比较峰面积的大小考察萃取剂对产物的影响。

1.3.5 发酵产物定性[13-14]

菌株FJS31-2抽提物37℃旋蒸得浸膏，取1 mg浸膏用3 mL色谱甲醇溶解，微孔滤膜过滤，设定HPLC进样体积统一为10 μL，根据化合物在HPLC上的出峰时间、峰型峰值与HRMS对比进行定性。

2 结果与分析

2.1 培养基组分对zunyimycin A和BE-24566B类化合物产量的影响

通过改变培养基成分，根据HPLC检测目标化合物吸收峰面积的大小，比较发酵产物的变化，结果见图2。

图2 培养基组成对卤化二型聚酮类化合物发酵产量的影响Fig.2 Effect of medium components on the fermentation yields of halogenated typeⅡpolyketides

由图2可知，当酵母粉含量高时可提高BE-24566B的产量，酵母粉含量＜4 g/L时不利于化合物产生，酵母粉可作为该化合物发酵的最佳有机氮源；而葡萄糖作为碳源对次级代谢产物的影响不及氮源的重要，当葡萄糖含量为4 g/L而酵母粉被硝酸铵或甘露醇代替时，化合物产量仍较低；碳源氮源以一定的比例添加体积分数1%乙醇浸泡过的腐殖酸，可提高次级代谢产物的产生，原始培养基BE-24566B产生峰面积为200，优化后峰面积达525，zunyimycin A峰面积由原来52提高至250，并优化出BE-24566B-1Cl化合物，所以将22号作为该菌发酵的最佳培养基。HPLC检测次级代谢产物存在BE-24566B、一氯取代衍生物（BE-24566B-Cl），发酵液的质谱信息中证实此化合物紫外吸收峰，zunyimycin A是卤化二型聚酮类二氯取代衍生物，三者之间基本母核相同仅取代基不同，推测发酵过程中三者是一个动态相互转化的过程[15]。

2.2 培养时间对zunyimycin A和BE-24566B类化合物产量的影响

菌株FJS31-2产生的卤化二型聚酮类化合物在生物体内是相互转化的过程，对此菌株而言培养时间是一个重要的影响因素，因此本次试验从发酵的第10天开始至第20天结束，每天以200 mL等体积萃取的分析方法考察培养时间的影响，结果见图3。

图3 培养时间对卤化二型聚酮类化合物发酵产量的影响Fig.3 Effect of fermentation time on the yield of halogenated typeⅡpolyketides

由图3可知，BE-24566B及其氯代衍生物在发酵至17 d时含量最高，以BE-24566B为主。在7 d同时检测到3种化合物，继续培养至11 d时含量均发生较大改变；17 d后迅速下降，21 d时BE-24566B-1Cl降至为0，可推测一、二氯取代的衍生物受菌体内部环境影响较大不稳定，因此将发酵17 d为该菌培养的最佳时间。

2.3 萃取剂对zunyimycin A和BE-24566B类化合物产量的影响

zunyimycin A和BE-24566B及BE-24566B-1Cl化合物母核结构相同，而氯原子取代的位置不同将会影响到化合物的极性，不同极性的溶剂萃取的产物将有差别。实验选取不同极性溶剂对发酵产物等体积萃取，通过HPLC检测目标产物峰面积的变化，结果见图4。

图4 萃取剂对卤化二型聚酮类化合物发酵产量的影响Fig.4 Effect of extraction agent on the yield of halogenated typeⅡpolyketides

由图4可知，以乙酸乙酯作为萃取时得到的目标化合物含量较高，因此选择乙酸乙酯剂作为萃取剂。

3 结论

实验通过改变培养基成分、培养时间、培养方式及发酵产物萃取溶剂的选择等因素，对链霉菌（Streptomycessp.）FJS31-2发酵条件进行优化，可以得出较优培养基组成为基础培养基内添加10 g/L无水乙醇浸泡24 h后的腐殖酸，培养17 d，采取乙酸乙酯萃取可以使目标化合物产量提高。固体培养除周期长，操作繁琐，影响发酵的因素难以检测外，目标化合物的产量要高于液体培养；液体发酵方式可以缩短发酵周期、对发酵影响因素可以实现在线考察，降低劳动力等优点，但产生目标化合物种类和含量都较低，后续实验还需进一步优化液体发酵条件，使目标化合物产量及效率得以进一步提升。

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Optimization of fermentation conditions for halogenated type II polyketides production from Streptomycessp.FJS31-2

WANG Yinyin1,2,3,WANG Miao3,QIAN Shengyan3,L Yuhong3,BAO Yuxin3,HU Yonglin4,YUE Changwu1,2,3*(1.Zunyi Key Laboratory of Genetic Diagnosis&Targeted Drug Therapy,The First People's Hospital of Zunyi City,Zunyi 563003,China; 2.The Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi 563003,China;3.Guizhou Key Laboratory of Microbial Resources& Drug Development,Zunyi Medical University,Zunyi 563003,China;4.Department of Clinical Laboratory Medicine,Zunyi Medical University, Zunyi 563003,China)

TakingStreptomycessp.FJS31-2 which produces zunyimycin A and BE-24566B halogenated natural compound as research object,the target compound obtained from the fermentation medium with different carbon and nitrogen sources at different culture time and extraction conditions were qualitatively and quantitatively analyzed by high resolution mass spectrum(HRMS)and high performance liquid chromatography(HPLC).Results showed when adding humic acid which soaked in the basic medium with 10 g/L absolute ethyl alcohol for 24 h,the target compound yield could be improved by ethyl acetate extraction at 17 d.

Streptomycetessp.;zunyimycin A;fermentation conditions;optimization

Q93-3

0254-5071（2017）01-0066-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.013

2016-07-25

国家自然科学基金(31160004，31460006)；贵州省科技学技术基金项目(黔科合J字[2010]2156，黔科合J字[2012]2348，黔科合SY字[2013]3013)

王荫荫（1989-），女，硕士研究生，研究方向微生物与天然产物资源开发。

*通讯作者：岳昌武(1975-)，男，教授，博士，研究方向为微生物天然产物发现与生物合成。