清香型大曲酯化酶活力的研究

唐取来，李晶晶，郭学武，肖冬光*

（1.教育部工业发酵微生物重点实验室，天津市工业微生物重点实验室天津300457，2.天津科技大学生物工程学院，天津300457）

清香型大曲酯化酶活力的研究

唐取来1,2，李晶晶1,2，郭学武1,2，肖冬光1,2*

（1.教育部工业发酵微生物重点实验室，天津市工业微生物重点实验室天津300457，2.天津科技大学生物工程学院，天津300457）

研究了乳酸质量浓度和pH对清香型大曲酯化酶活力的影响，结果表明，乳酸质量浓度对大曲酯化酶活力有很大影响，当乳酸质量浓度较低时，大曲中的酯化酶表现为合成作用，分别在低于8 g/L和16 g/L时催化乳酸乙酯和乙酸乙酯的合成；当乳酸质量浓度较高时，酯化酶表现为水解作用，将酯分解为相应酸和醇；pH对大曲酯化酶酯分解活力影响显著，在pH值为2.0时，酯的分解主要为化学分解，在pH值为3.0～6.0时，化学分解和酯化酶分解都起作用。实验发现在pH值为4.0时大曲酯化酶催化乙酸乙酯合成的活力最强，100 h时乙酸乙酯质量浓度达188.8 mg/L；pH值为5.0时催化乳酸乙酯合成的活力最强，100 h时乳酸乙酯质量浓度达182.6 mg/L。

清香型大曲；酯化酶；合成；分解

清香型白酒的历史源远流长，它的主体香气是乙酸乙酯和乳酸乙酯[1]。其特点是清香纯正、自然协调、醇甜柔和、后味爽净[2]。白酒中酯类的形成大体有三条途径：一是微生物代谢副产物，二是酒醅中酸和醇在化学或大曲酯化酶作用下合成，三是白酒蒸馏和贮藏过程中通过化学反应形成。王涛等[3-4]认为酒中乙酸乙酯是产酯酵母胞内酶的代谢产物，酯化以前中期为主；李河等[5]认为乳酸乙酯一是配醅带入，二是酒醅中大量乳酸而形成。酸和醇通过化学反应生成酯是一个缓慢的过程，达到平衡往往需要很长时间[6]。

大曲在酿造过程中为发酵、产香提供了微生物群系和风味前驱物质，而且也提供了丰富的生物催化剂酶。大曲中的酯化酶能使一个酸元和一个醇元结合、脱水而生成酯，大大加速了酯的形成速率，但是大曲酯化酶也能分解酯，生成相应的酸和醇[7-9]。对酯化酶的研究始于20世纪80年代，多研究酯化酶在浓香型白酒中对己酸乙酯的合成作用[10]。对于清香型白酒，其主体香气为乙酸乙酯和乳酸乙酯，研究清香型大曲的酯化酶活力，有利于了解大曲酯化酶对乙酸乙酯形成的补充作用及其在乳酸乙酯形成中的作用[11]。针对白酒发酵过程中乳酸含量较高的特点，本实验研究了乳酸质量浓度和pH对清香型大曲酯化酶活力的影响[12]。有利于了解发酵过程中乳酸对大曲酯化酶活力的影响，分析清香型白酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的合成机制，解决清香型白酒中乳酸乙酯含量过高的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清香型大曲：储存3～6个月，某清香型白酒厂提供。乙酸、乳酸、乙醇（均为分析纯）：天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890B气相色谱仪、Agilent HP-INNOWAX气相色谱柱（30 m×320 μm×0.25 μm）：Agilent有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博讯实业医疗设备厂有限公司；ES-3610K电磁炉：成都川西行料工贸有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 乳酸质量浓度对大曲酯化酶活力的影响

在体积分数20%乙醇溶液中，添加1 g/L乙酸、5 g干曲，乳酸质量浓度分别为4 g/L、6 g/L、8 g/L、12 g/L、16 g/L、20 g/L，30℃保温酯化100 h。同时做不加曲的空白对照实验，测定乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量。

1.3.2 pH对大曲酯化酶活力的影响

在体积分数20%乙醇溶液中，添加2 g/L乙酸、3 g/L乳酸，再加5 g干曲，用NaOH或H2SO4分别调pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，于30℃静置100 h，同时做不加曲的空白对照实验，测定乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量。

1.3.3 pH对大曲酯化酶主要酯分解活力的影响

在体积分数20%乙醇溶液中分别按体积量加入0.1%的乙酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸异戊酯；分装于250 mL三角瓶中，每瓶100 mL；分别加入pH为3.0、4.0、5.0的柠檬酸缓冲溶液10 mL，加5 g干曲，于30℃静置100 h。同时做不加曲的空白对照实验，测定不同酯的分解率。

1.3.4 分析方法

（1）风味物质的测定

量取100 mL酯化液于500 mL蒸馏瓶中，加入100 mL蒸馏水，加热蒸馏，接收蒸出液100 mL，采用载气为高纯氮气，进样口温度200℃，检测器温度150℃，程序升温（起始温度50℃，保持8min，以5℃/min升至150℃，保持15min），分流比为10∶1，进样体积为1 μL的气相色谱法检测乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸异戊酯等风味物质的含量[13-14]；对照组在蒸馏之前加曲。

（2）酯分解率测定

量取100 mL混合液于500 mL蒸馏瓶中，加入100 mL蒸馏水，加热蒸馏，接收蒸出液100 mL，采用1.3.4（1）中的气相色谱法检测各酯含量；对照组在蒸馏之前加曲，酶分解率计算公式如下。

2 结果与分析

2.1 乳酸质量浓度对大曲酯化酶活力的影响

酸类物质是白酒中酯合成的前体，乳酸、乙酸是清香型白酒发酵中重要的两种酸。传统清香型白酒发酵过程中，酒醅中乙酸含量在1 mg/g左右，乳酸含量达20 mg/g左右[15]。添加不同质量浓度乳酸对大曲酯化酶合成乙酸乙酯和乳酸乙酯的影响，结果如表1、表2所示。

表1 乳酸质量浓度对大曲酯化酶合成乙酸乙酯的影响Table 1 Effect of lactic acid concentration on the synthesis of ethyl acetate byDaquesterifying enzymes

由表1可知，在对照组中，乙酸乙酯含量随乳酸质量浓度的增加而增加；而添加大曲后，乙酸乙酯含量随乳酸质量浓度的增加呈下降趋势；差值逐渐减小并成为负数。说明当乳酸质量浓度较低时，大曲中的酯化酶表现为合成作用，催化乙酸乙酯的合成；随乳酸质量浓度的增加，大曲酯化酶对乙酸乙酯合成作用减弱；至乳酸质量浓度为16 g/L时，大曲酯化酶表现为水解作用。可能是过高的乳酸含量改变了酶的活性中心，使其更偏向于分解反应，或乳酸与乙酸产生竞争性抑制作用等。

表2 乳酸质量浓度对大曲酯化酶合成乳酸乙酯的影响Table 2 Effect of lactic acid concentration on the synthesis of ethyl lactate byDaquesterifying enzymes

由表2可知，对照组中，随乳酸质量浓度的增加，乳酸乙酯含量呈增加趋势；添加大曲后，乳酸乙酯含量上升速度明显较对照组缓慢；差值由正值变为负值。说明当乳酸质量浓度较低时，大曲中的酯化酶表现为合成作用，催化乳酸乙酯的合成；随乳酸质量浓度的增加，酯化酶对乳酸乙酯合成活力在下降；至乳酸质量浓度为8 g/L时，大曲酯化酶表现为水解作用。

在对照组中，酯类的合成为单纯的化学作用，乳酸质量浓度的增加不仅使乳酸乙酯含量增加，还能促进乙酸乙酯的合成；添加大曲后，在体积分数20%乙醇溶液中，微生物被抑制，基本不发挥作用；酯的合成是化学合成和酯化酶催化共同作用的结果。差值可以反映大曲中的酯化酶在酯的合成中起到的作用。随乳酸质量浓度的增加，差值逐渐由正值变为负值，说明大曲中的酯化酶在酯合成中的作用在变化，由合成作用变为水解作用。分析原因可能是过高的酸浓度使酯化酶的结构发生了变化，增强了其分解活力；还可能是大曲作为pH的缓冲剂，影响了酸强度，减弱了酯的合成。

2.2 pH对大曲酯化酶活力的影响

酶的活性受环境pH影响极为显著，只有在一定pH值范围内，酶才表现出活性。pH对大曲酯化酶合成乙酸乙酯及乳酸乙酯的影响，结果如表3、表4所示。

表3 pH对大曲酯化酶合成乙酸乙酯的影响Table 3 Effect of pH on the synthesis of ethyl acetate byDaqu esterifying enzymes

由表3可知，在对照组中，随pH增大，乙酸乙酯合成量下降，pH 2.0～3.0时乙酸乙酯合成量下降显著，pH＞3.0时，合成量都很低。添加大曲后，随pH增大，乙酸乙酯含量出现反复升降，在pH为2.0时出现最大值，6.0时有最小值。pH值为2.0时，差值为负数，说明大曲酯化酶起分解作用，酯的合成以化学合成为主；pH＞3.0，差值均为正值，说明pH＞3.0时，大曲中的酯化酶能促进乙酸乙酯的合成，酯的合成以大曲酯化酶催化为主；pH＞4.0，酯化酶对乙酸乙酯的合成能力下降。综上分析，大曲中酯化酶合成乙酸乙酯的最适pH值在4.0左右。

表4 pH对大曲酯化酶合成乳酸乙酯的影响Table 4 Effect of pH on the synthesis of ethyl lactate byDaqu esterifying enzymes

由表4可知，在对照组中，随pH增大，乳酸乙酯合成量下降，pH 2.0～3.0乳酸乙酯合成量下降显著，pH＞3.0时，合成量都很低。添加大曲后，随pH增大，乳酸乙酯含量呈先下降后上升再下降趋势，在pH值为2.0时出现最大值，3.0时有最小值。pH值为2.0时，差值为负数，说明大曲酯化酶起分解作用，酯的合成以化学合成为主；pH＞3.0，大曲中的酯化酶能促进乳酸乙酯的合成，酯的合成以大曲酯化酶催化为主；pH＞5.0时，大曲酯化酶对乳酸乙酯合成能力下降。综上分析，大曲酯化酶合成乳酸乙酯最适pH值为5.0左右。

2.3 pH对大曲酯化酶主要酯分解活力的影响

在含乙酸乙酯、乙酸异戊酯和乳酸乙酯的乙醇溶液中，加入pH值为3.0、4.0、5.0的柠檬酸缓冲溶液、大曲，不同时间条件下蒸酒测各种酯含量的变化。研究不同pH缓冲溶液中大曲酯化酶对各酯分解随时间的变化情况，结果见图1～图3。

2.3.1 pH值对大曲酯化酶分解乙酸乙酯的影响

图1 不同pH缓冲溶液中乙酸乙酯的分解率Fig.1 Decomposition rate of ethyl acetate in different pH buffer solution

由图1可知，在对照组中，pH变化对乙酸乙酯的分解有一定影响，三种pH条件下，乙酸乙酯分解趋势基本一致。添加大曲之后，在pH为3.0的缓冲体系中，乙酸乙酯分解趋势与对照实验相似，说明pH为3.0时，大曲酯化酶分解活力不高，对乙酸乙酯的分解不起作用，乙酸乙酯的分解以化学分解为主；pH为4.0和5.0时，乙酸乙酯分解速率加快，酯化酶表现出较强的分解活力，乙酸乙酯的分解以大曲酯化酶分解为主。说明在较低pH条件下，大曲酯化酶对乙酸乙酯分解活力低，有利于其维持在一个较高的浓度，pH变大，大曲酯化酶对乙酸乙酯分解活力加强。

2.3.2 pH值对大曲酯化酶分解乙酸异戊酯的影响

由图2可知，对于乙酸异戊酯，其分解较为迅速，在第10天时，pH=3.0对照、pH=3.0实验、pH=4.0对照、pH=4.0实验、pH=5.0对照、pH=5.0实验组分解率分别为57.96%、82.56%、60.98%、91.97%、66.34%、94.96%，随pH增大，乙酸异戊酯分解速率加快。添加大曲后，三种pH条件下，分解速率都大于对照组，说明化学分解和大曲酯化酶对乙酸异戊酯的分解都起作用。在三种pH条件下，大曲酯化酶对乙酸异戊酯分解活力都较强。酯的合成和分解是可逆反应，在实验体系中，乙酸和异戊醇的含量都很低，故分解速率远远大于合成速率，表现为酯含量下降。

图2 不同pH缓冲溶液中乙酸异戊酯分解率Fig.2 Decomposition rate of isoamyl acetate in different pH buffer solution

2.2.3 pH值对大曲酯化酶分解乳酸乙酯的影响

图3 不同pH缓冲溶液中乳酸乙酯的分解率Fig.3 Decomposition rate of ethyl lactate in different pH buffer solution

由图3可知，对于乳酸乙酯的分解，在第10天时pH= 3.0对照、pH=3.0实验、pH=4.0对照、pH=4.0实验、pH=5.0对照、pH=5.0实验组分解率分别为26.32%、9.89%、8.07%、8.15%、2.36%、10.30%。对照组中，pH越小，乳酸乙酯的分解越快；添加大曲后，乳酸乙酯分解速率基本相同。在pH为3.0的缓冲体系中，添加大曲后乳酸乙酯分解率减小，说明大曲酯化酶起到合成作用，抑制乳酸乙酯的分解，全部为化学分解；在pH为4.0的缓冲体系中，添加大曲对分解速率基本无影响，说明大曲酯化酶基本不起作用，化学分解作用为主；在pH为5.0的缓冲体系中，添加大曲后乳酸乙酯分解率显著增加，说明两种分解都起作用，大曲酯化酶分解作用为主。

3 结论

乳酸质量浓度对大曲酯化酶活力有很大影响，当乳酸质量浓度较低时，大曲中的酯化酶表现为合成作用，分别在低于8 g/L和16 g/L时催化乳酸乙酯和乙酸乙酯的合成；当乳酸质量浓度较高时，大曲中的酯化酶表现为水解作用，将酯分解为相应酸和醇。发酵过程中，乳酸质量浓度逐渐增加。发酵前期，酯化酶对乙酸乙酯和乳酸乙酯有一定合成作用，当乳酸质量浓度过高时，酯化酶表现为抑制酯的合成，对降低乳酸乙酯含量有一定的积极意义。

pH对大曲酯化酶合成乙酸乙酯和乳酸乙酯显著影响，pH较低（pH=2.0）时，酯的合成以化学合成为主，酯化酶起分解作用；pH在3.0～6.0范围内，酯的合成以大曲酯化酶催化为主。大曲酯化酶对乙酸乙酯和乳酸乙酯合成最适pH不同，pH值为4.0时，大曲酯化酶催化乙酸乙酯合成的活力最强；pH值为5.0时，大曲酯化酶催化乳酸乙酯合成的活力最强。

pH对大曲酯化酶酯分解活力影响显著，在pH值为2.0时酯的分解主要为化学分解，pH在3.0～6.0时，化学分解和酯化酶分解都起作用。

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Esterifying enzymes activity of light-flavorDaqu

TANG Qulai1,2,LI Jingjing1,2,GUO Xuewu1,2,XIAO Dongguang1,2*(1.Key Lab of Industrial Fermentation Microbiology of Ministry of Education,Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology,Tianjin 300457,China;2.College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

The effects of lactic acid concentration and pH on esterifying enzymes activity were discussed.The results showed that,the lactic acid concentration had great effect on esterifying enzymes activity ofDaqu.When the lactic acid concentration was low,the esterifying enzymes showed synthesis effect,catalysing ethyl lactate(lactic acid less than 8 g/L)and ethyl acetate(lactic acid less than 16 g/L)synthesis.When the lactic acid concentration was high,the esterifying enzymes showed hydrolysis effect,so the ester was decomposed into acid and alcohol.pH showed significant effect on esterifying enzymes decomposition activity ofDaqu,the decomposition of the ester was mainly chemical decomposition at pH 2.0,and chemical decomposition and esterifying enzymes decomposition both play a role at pH 3.0-6.0.The optimum pH for ethyl acetate synthesis by esterifying enzymes was 4.0,which produced 188.8 mg/L ethyl acetate at 100 h,and for the pH 5.0 buffer,it produced 182.6 mg/L ethyl lactate at 100 h.

light-flavorDaqu;esterifying enzymes;synthesis;hydrolysis

TS262.31

0254-5071（2017）01-0035-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.007

2016-06-30

国家自然科学基金资助项目(3147172)；中国白酒3C计划项目

唐取来(1991-)，女，硕士研究生，研究方向为现代酿造技术。

*通讯作者：肖冬光(1956-)，男，教授，博士，研究方向为现代酿造技术。