高效液相色谱法测定牛奶中速灭威、克百威、异丙威农药残留

黄 霞，刘 芳，聂 立，兰瑞容，彭章明

(宜宾市食品药品检验检测中心，四川宜宾644000)

高效液相色谱法测定牛奶中速灭威、克百威、异丙威农药残留

黄 霞，刘 芳，聂 立，兰瑞容，彭章明

(宜宾市食品药品检验检测中心，四川宜宾644000)

建立了牛奶中速灭威、克百威（呋喃丹）、异丙威的高效液相色谱测定与确证方法。3种氨基甲酸酯类农药标准曲线线性关系良好；相关系数R2为0.990～0.996；检出限为6.13～7.87 μg/kg；回收率为70.4%～102.5%。该方法准确、灵敏、快速，可满足检测需要。

牛奶；高效液相色谱；速灭威；克百威；异丙威

氨基甲酸酯类农药是继有机磷、有机氯农药之后广泛使用的杀虫剂，此类杀虫剂进入人体内可抑制乙酰胆碱酯酶，造成急性中毒，刺激中枢神经系统，对人类健康存在潜在的危险。该类农药是以甲酸酯为前体化合物发展而来的农药，具有分解快、残留期短、低毒、高效和选择性强的特点，主要用于粮食、蔬菜和水果等农产品[1]。随着氨基甲酸酯类杀虫剂施用于土壤中，可防治土壤中的多种害虫和线虫，但容易导致在植物中的残留，给食草性动物食品带来新的使用安全问题。

目前，国家标准和行业标准方法体系中有关氨基甲酸酯类农药的检测方法有GB/T5009.199—2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》[2]；SN/T 2572—2010《进出口蜂王浆中多种氨基甲酸酯类农药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》[3]；GB/T 5009.163—2003《动物性食品中氨基甲酸酯类农药多组分残留高效液相色谱测定》[4]；NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》[5-6]。在国内外的分析报道中，检测方法主要有气相色谱法（gas chromatography，GC）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、气相色谱串联质谱法（gas chromatography-tandem mass spectrometer，GC-MS/MS）、高效液相色谱串联质谱法（highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometer，HPLC-MS/MS）等[7-13]。这些方法各有优缺点，由于氨基甲酸酯类化合物极性强，热稳定性较差，使用GC或GC-MS检测时常需采用特殊的技术和手段才能准确测定且方法复杂。诸多方法中，虽然液质联用技术已趋近成熟，但其成本昂贵，一般实验室难以推广应用。而高效液相色谱法检测氨基甲酸酯类农药残留具有选择性强、灵敏度较高、重现性较好且易于实现等优点。本研究期望探索建立一种检测牛奶中氨基甲酸酯类农药残留的简便、高效、快速的高效液相色谱分析检测技术，这对保证牛奶产品质量安全、保障人们生命健康以及加强环境保护均有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙酸铅（分析纯）、乙腈（色谱纯）：山东禹王实业有限公司化工分公司；异丙威标准品（纯度98.5%）、速灭威标准品（纯度98%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；克百威标准储备液（100 μg/mL）：北京海岸鸿蒙标准物质技术有限公司。

1.2 仪器与设备

安捷伦1260高效液相色谱仪带二极管阵列检测器、XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱：美国安捷伦公司；AE240电子天平：美国METTLER公司；JM-B10002电子天平：余姚市纪铭称重校验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备

分别称取异丙威0.014 7 g、速灭威0.013 8 g标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，得到质量浓度为1.45 mg/mL的异丙威标准储备液，质量浓度为1.35 mg/mL的速灭威标准储备液。分别吸取速灭威和异丙威标准储备液0.10 mL，克百威标准储备液1.00 mL于同一10 mL容量瓶中，甲醇定容至10 mL，得到混合标准中间液（异丙威质量浓度为14.5μg/mL，速灭威质量浓度为13.5μg/mL，克百威质量浓度为10μg/mL的混合标准中间液）。再取混合标准中间液1.00 mL到10 mL容量瓶中，甲醇定容至10 mL，得到异丙威质量浓度为1.45 μg/mL，速灭威质量浓度为1.35 μg/mL，克百威质量浓度为1 μg/mL的混合标准工作液。分别取混合标准工作液：0.2mL、0.5mL、1mL至进样瓶中，甲醇稀释至1mL；再分别取混合标准中间液：0.2 mL、0.3 mL至进样瓶中，甲醇精确稀释至1.0 mL，得标准曲线。

1.3.2 样品溶液的制备

准确称取混匀样品（约30 g，纯牛奶）于50 mL离心管中，吸取乙腈20.00 mL，加入4 g氯化钠，2 mL乙酸铅溶液，剧烈振摇2 min，超声提取30 min，4 000 r/min离心5 min，准确吸取上清液5.00 mL于10 mL试管中，氮气吹干，准确吸取1.00 mL甲醇复溶，过0.45 μm滤膜，上机检测。

1.3.3 仪器条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；流动相：乙腈∶水（50∶50，V/V）；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样体积：5μL；二极管阵列检测器波长：210nm。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以待测组分质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行回归，得到线性回归方程y=ax+b，结果见表1。

表1 标准曲线回归方程Table 1 Standard curve regression equations

由表1可知，标准曲线相关系数R2分别为0.996、0.993、0.990，线性关系较好。

2.2 检测限

根据标准曲线STD1最低点浓度的信噪比（标准曲线最低点浓度的色谱图见图1），将3倍信噪比时的待测组分浓度作为仪器最低检测浓度，再根据样品前处理的稀释倍数及取样量，计算出本方法的检测限，结果见表2。

由表2可知，3种农药检测限分别为速灭威6.13 μg/kg，克百威6.93 μg/kg，异丙威7.87 μg/kg。本方法测得的检出限低于GB/T 5009.163—2003（速灭威为7.8 μg/kg，克百威7.3 μg/kg，异丙威13.3 μg/kg）的要求，满足检测要求。

图1 混标溶液HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standards

表2 3种农药的检测限Table 2 Detection limits of three pesticides

2.3 加标回收率

选取未含待测组分的牛奶作为加标试样，3个水平每个水平6个平行。进行加标回收实验，结果见表3。

表3 加标回收率实验结果Table 3 Experimental results of adding standard recoveries

由表3可知，该方法回收率为70.4%～102.5%，能满足检测要求。

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

在GB/T 5009.163—2003方法中氨基甲酸酯类农药残留分析中所用的萃取溶剂为丙酮和二氯甲烷的混合溶液，在相同实验条件下，添加0.02 mL混合标准中间液于样品中，分别用丙酮40 mL和二氯甲烷30 mL的混合溶液和乙腈20 mL进行萃取，试验结果表明，使用丙酮和二氯甲烷作为提取溶剂的回收率明显低于乙腈作为提取剂的回收率[8]。综合考虑提取效率、基质干扰、样品的选择性、与样品混合性、溶剂化作用和渗透能力等因素，本方法采用乙腈作为氨基甲酸酯类农药残留量的提取剂[14-17]。

3.2 净化方式的选择

在GB/T 5009.163—2003方法中氨基甲酸酯类农药残留分析采用的净化方式为凝胶柱，凝胶的价格昂贵，成本很高。因此本实验考察了C18小柱、PEP固相萃取小柱和乙酸铅沉淀蛋白质三种净化方式，结果表明，使用C18小柱、PEP固相萃取小柱净化的样品回收率很低，而使用乙酸铅沉淀蛋白质进行净化的样品回收率能满足检测需要[9-10]。牛奶样品中色素含量很低，而脂肪和蛋白质含量较高，通过乙酸铅沉淀离心后，明显分层。直接取上清液氮吹，浓缩，定容，上机，操作过程中损失小，且操作方便，可以满足检测需要[18]。

3.3 流动相的选择

对3种待测物进行紫外光谱扫描，确定检测波长均为210 nm，GB/T 5009.163—2003种选用的流动相为甲醇+水（60+40），而在此流动相下，标准品中的色谱杂峰较多，且杂峰响应值高，影响待测组分检测，分析原因主要是甲醇的紫外最大吸收波长为200 nm附近，所当待测组分检测波长为210 nm时，干扰较大。将流动相换为（乙腈+水）=（50+50），乙腈紫外最大吸收波长为190 nm附近，比甲醇低，适合待测组分的检测。调整流动相比例为（乙腈+水）=（50+50），使杂质与待测组分分离，灵敏度也能满足检测的需要。

3.4 结果及存在的问题

实验中待测组分的响应值还不够理想，为了达到标准检出限，本方法采用增大称样量的方式。在未来的研究中，主要还可以从前处理和仪器条件两大方面来提高待测组分的响应值，可以增大进样体积，本实验的进样体积为5μL，进样体积较小，且牛奶样品相对含有色素及其他杂质较少，前处理相对较为简单，在未来的研究中还可以针对不同的样品进行前处理的优化。

4 结论

本方法对提取溶剂、净化方式和流动相做了优化。速灭威检测限为6.13 μg/kg、克百威检测限为6.93 μg/kg、异丙威检测限为7.87 μg/kg，低于GB/T5009.163—2003方法中的检测限（速灭威7.8 μg/kg、克百威（呋喃丹）7.3 μg/kg、异丙威13.3 μg/kg），说明本方法比标准方法的检测限更低，更能满足检测需要。

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[3]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 2572—2010进出口蜂王浆中多种氨基甲酸酯类农药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法[S].北京：中国标准出版社，2010.

[4]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.163—2003动物性食品中氨基甲酸酯类农药多组分残留高效液相色谱测定[S].北京：中国农业出版社，2003.

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Determination of metolcarb,carbofuran and isoprocarb contents in milk by HPLC

HUANG Xia,LIU Fang,NIE Li,LAN Ruirong,PENG Zhangming(Yibin Institute for Food and Drug Control,Yibin 644000,China)

A new method for determination and conformation of metolcarb,carbofuran,and isoprocarb in milk by HPLC was developed.The proposed method showed a good linearity with the linear correlation coefficientsR2of 0.990-0.996 and detection limits of 6.13-7.87 μg/kg.The average recoveries were in the range of 70.4%-102.5%.The method was accurate,sensitive,rapid,and can meet the needs of detection.

milk;HPLC;metolcarb;carbofuran;isoprocarb

O657.7

0254-5071（2017）01-0168-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.035

2016-08-13

黄霞（1986-），女，工程师，硕士，主要从事食品检测工作。