基于nano LC-LTQ/Orbitrap MS分析山羊角中蛋白质多肽类物质

刘 睿，朱振华，钱大玮，段金廒

(1.南京中医药大学，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023；2.江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室，江苏 南京 210023；3.江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京 210023)

基于nano LC-LTQ/Orbitrap MS分析山羊角中蛋白质多肽类物质

刘 睿1,2,3，朱振华1,3，钱大玮1,3，段金廒1,3

(1.南京中医药大学，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023；2.江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室，江苏 南京 210023；3.江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京 210023)

基于shotgun混合蛋白质鉴定思路，研究山羊角水提液中蛋白质类、肽类物质组成。采用超高分辨的线性离子阱-静电场轨道阱质谱(LTQ/Orbitrap MS)，从山羊角水提液中大于3 ku部位鉴定出52个蛋白质，从小于3 ku部位鉴定出1 288个肽段，这些肽段源于46个蛋白质。鉴定出的蛋白质主要为角蛋白、胶原蛋白、角蛋白相关蛋白等结构蛋白。根据每个氨基酸出现的频次，将蛋白质上的肽段标记，绘制热图(heat map)，据此推测山羊角水提液中多肽类物质形成的过程为：从蛋白质的热区(hot regions)中经过降解、脱落、溶出，形成水提液中的各种肽段。该方法能够快速、高效地分析鉴定山羊角水提液中蛋白质肽类物质组成，可用于角类动物药蛋白质类物质组成与分析，也可为中药动物药的系统研究提供借鉴与方法参考。

山羊角；蛋白质；肽类；shotgun；鉴定

山羊角(CapraeHircusCornu)味咸、性寒，具清热、镇惊、散瘀止痛之功效，《医林纂要》中记载山羊角“功用近羚羊角”。由于羚羊角资源日渐紧缺，无法满足临床需求，国家行业部门研究比较了羚羊角与其他角类在抗惊厥、镇痛、镇静、解热等方面的功效特点[1-3]，于1987年6月发布《卫生部关于推广应用鹅喉羚羊角、黄羊角、山羊角的通知》([87]卫药字第33号文)指出：“鹅喉羚羊角、黄羊角、山羊角同羚羊角具有相似功效，可以作为药材供药用”。因前两者为国家二级保护动物，禁止捕杀，因此，目前中医临床调剂、中药制药行业等常以山羊角替代羚羊角使用，疗效确切[4]。

山羊角的传统用法为水煎煮得其提取液。现代研究表明，山羊角中含有丰富的蛋白质类、肽类、核苷类物质[5-6]，但山羊角水提液中的物质组成有待深入研究。角质类中药经高温提取后，通常以蛋白质经非特异性降解得到的多肽片段为主[7]，这些肽段的亲水性、疏水性、分子质量分布、重复片段情况等与其生物活性密切相关。

基于串联质谱的shotgun技术是近年发展起来的用于混合蛋白质、混合多肽快速鉴定的方法之一[5,7]。已有研究采用LC-MS/MS法分析赛加羚羊角提取物中的肽段信息，且确定这些肽段的来源蛋白为Ⅰ型角蛋白(Keratin, type Ⅰ)、Ⅱ型角蛋白(Keratin, type Ⅱ)、Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)等[8]。本工作拟采用nano LC-LTQ/Orbitrap MS技术对山羊角水提液中的蛋白质肽类物质进行系统分析，确定其中蛋白信息、肽段序列、来源蛋白、分子质量分布、片段重复情况等重要信息，希望为进一步开展山羊角功效物质基础研究提供依据，也为中药动物药的系统研究提供借鉴与方法参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

戴安U3000 Nano RSLC纳升液相系统：美国Dionex公司产品；Thermo LTQ Orbitrap XL质谱仪：美国Thermo Fisher公司产品；Millipore Mini Pellicon超滤系统：美国Merck Millipore公司产品；BP 211D 电子天平：德国Sartorius公司产品；Rotavapor R-210旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司产品；Freezone 4.5 plus冷冻干燥机：美国Labconco公司产品。

十二烷基硫酸钠(SDS)，二硫苏糖醇(DTT)，碳酸氢铵，胰蛋白酶(Promega质谱测序级)，乙腈，甲醇，甲酸等：均为质谱级，德国Merck公司产品。

山羊角药材：收集于江苏省淮安市盱眙县，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为牛科动物山羊CaprahircusLinnaeus的角。

1.2 样品制备

将山羊角去角塞、洗净、粉碎后，加入10倍量的水煎煮两次，第一次煎煮10 h，第二次煎煮8 h，合并滤液，以10 000 r/min离心10 min，取上清液，用超滤系统对上清液进行分段处理，选择超滤膜的截留分子质量为3 ku，经超滤分离后，收集分子质量低于3 ku的部位(F1)和高于3 ku的部位(F2)，分别浓缩，冷冻干燥后，置于-20 ℃保存。

取5 mg F2部位冻干粉，用50 mmol/L碳酸氢铵复溶，加入1%胰蛋白酶，于37 ℃反应过夜，然后于90 ℃孵育5 min灭活后，以10 000 r/min离心10 min，取上清液，保存留用。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件 戴安U3000 nano RSLC纳升液相系统，Reprosil C18 AQ色谱柱(75 μm×150 mm, 5 μm)；上样量5 μL；流速400 nL/min；流动相：A为乙腈-甲酸水溶液(2∶0.2∶98，V/V/V)，B为乙腈-甲酸水溶液(80∶0.2∶20，V/V/V)；线性梯度洗脱：2%～30%B，150 min。

1.3.2 质谱条件 选用Thermo LTQ Orbitrap XL质谱仪进行肽段分析，喷雾电压2.5 kV，离子传输毛细管温度200 ℃；质谱一级全扫描范围为m/z300～2 000，分离宽度为3 u；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离(CID)二级串联质谱分析；采用Xcalibur软件进行数据采集。

二级质谱数据采用PEAKS 7.5软件进行搜库鉴定分析，选择牛科(Bovidae，Uniport下载，bovidae_uniprot-taxonomy_9895，2015-6-28下载)数据库，检索参数设置为：前体离子误差10×10-6，子离子误差1 u，半胱氨酸残基固定修饰(氨甲酰甲基化57.02 u)，甲硫氨酸残基可变修饰(氧化+15.99 u)，N-端乙酰化(+42.01 u)，氨基甲酰化(+43.01 u)；允许2个位点误切，假阳性率(FDR)≤1%；根据山羊角水提液样品不同，选择不同酶切方式：非酶切(No enzyme)或胰蛋白酶酶切(Trypsin)；其他为默认参数，在上述检索条件下所得分值有显著性意义(p<0.05)，被认定为有效的鉴定结果。

2 结果与讨论

2.1 山羊角水提液中蛋白质类物质鉴定

基于shotgun蛋白质鉴定方法，从山羊角F2部位中共鉴定了52个蛋白质(唯一肽段数≥2)，其中13个角蛋白(Keratin, KRT)、4个胶原蛋白(Collagen)、3个角蛋白相关蛋白(Keratin-associated protein, KAPs)、2个微管蛋白(Tubulin)、1个热休克蛋白(Heat shock protein)和一些其他未知功能蛋白等。以角蛋白为例，Ⅰ型角蛋白的唯一肽段数为5，而其总肽段数为84，鉴定的肽段在蛋白质中的覆盖率达到56.07%，可确定为角蛋白(sp|P02534|K1M1_SHEEP)。

山羊角中含有大量的角蛋白、胶原蛋白等水溶性蛋白质，在高温煎煮条件下，蛋白质原有的结构被破坏，如发生二硫键断裂、空间结构改变、非特异性水解等，从而产生变性蛋白或非特异性降解蛋白溶出，进入水提液中。山羊角水提液经超滤分离后，F2部位主要为分子质量大于3 ku的变性蛋白或蛋白碎片。通过本实验的鉴定方法无法确定这些蛋白质经过变性、降解后，以哪些变性蛋白或降解蛋白的形式存在于水提液中，仅能确定水提液中存在的变性蛋白或降解蛋白是源于这52个蛋白质。

2.2 山羊角水提液中肽类成分的分析与鉴定

山羊角水提液经超滤分段后，F1部位主要成分为分子质量小于3 ku的肽段，根据F1的MS/MS质谱碎片信息，采用非酶切(No enzyme)模式进行数据库比对分析，从F1中共分析鉴定了1 288个多肽的氨基酸序列信息，这些肽段为46个蛋白质的降解产物(唯一肽段数≥2)，其中包括19个角蛋白(KRT)，4个角蛋白相关蛋白(KAPs)。

在鉴定的1 288个肽段中，对每个氨基酸残基出现的次数进行统计，其出现频次示于图1。其中，谷氨酸(Glu, E)出现次数最多，达2 002次；其他的亲水氨基酸，如天冬氨酸(Asp, D)、甘氨酸(Gly, G)、赖氨酸(Lys, K)、天冬酰胺(Asn, N)、谷氨酰胺(Gln, Q)、精氨酸(Arg, R)、丝氨酸(Ser, S)及苏氨酸(Thr, T)出现次数均大于800次；疏水氨基酸仅有丙氨酸(Ala, A)、异亮氨酸(Ile, I)、亮氨酸(Leu, L)及缬氨酸(Val, V)出现次数大于800次。亲水氨基酸出现的次数总和为11 182次，疏水氨基酸出现的次数总和为6 860次。以上结果表明，山羊角水提液中的肽段多数具有亲水性。肽段的分子质量分布统计结果示于图2。可见，肽段的分子质量介于715.27～3 763.63 u之间，其中，81.68%的肽段分子质量低于2 000 u。通常认为，肽段的分子质量低于2 000 u将有利于肽段透过生物屏障发挥功效[9]。

图1 山羊角水提液F1所有肽段中氨基酸的出现频次Fig.1 Frequencies of the amino acids in all identified peptides in F1 of Caprae Hircus Cornu

图2 山羊角水提液F1中所有肽段的分子质量分布Fig.2 MW distribution of the identified peptides in F1 of Caprae Hircus Cornu

通过nano LC-MS/MS结合蛋白质搜库鉴定的思路，鉴定了山羊角水提液中可溶性肽段与蛋白质信息。肽段的氨基酸序列表明，这些肽段多数源于KRT和KAPs，鉴定结果可在一定程度上解释山羊角水提液中肽段的形成过程。根据每个氨基酸出现的频次，将蛋白质上的肽段标记，绘制“热图(heat map)”，示于图3。图中，颜色越红，表明氨基酸出现频次越高，蛋白质的这部分肽段可被认为是一个“热区(hot regions)”，处于热区内的氨基酸为出现频次较高的氨基酸序列，表明这些肽段的序列易于降解、脱落、溶出，最终形成提取液中的各种肽段[10]。

以角蛋白(Keratin 34，E3VW79_SHEEP)为例，山羊角水提液中共有221个肽段源于该蛋白，其中14个是唯一肽段，唯一肽段数>2，可确定该蛋白为山羊角水提液中肽段的来源蛋白之一。肽段(G69-R82)的鉴定图和肽段在Keratin 34中的分布情况示于图4。根据MS/MS图谱与蛋白质数据库比对搜库结果，确定肽段的氨基酸序列，以肽段GNEKETMQ-FLNDR为例，m/z791.37的主要碎片离子峰包括y1+(175.12)、y2+(290.15)、y3+(404.19)、y4+(517.27)、y5+(664.34)、y6+(792.40)、y7+(923.44)、y8+(1 024.49)、y9+(1 153.53)、y10+(1 281.64)、b3+(301.11)、b5+(558.25)、b6+(659.30)。经鉴定，GNEKETMQFLNDR源于Keratin 34，E3VW79_SHEEP蛋白的G69-R82肽段。GNEKETMQFLNDR可能的产生过程为：在高温煎煮过程中，蛋白质变性、溶出，释放出肽段S67-L114，而后，肽段进一步降解，释放出更多短肽段，其中G69-R82肽段GNEKETMQFLNDR可能是进一步水解释放的产物。

注：每个氨基酸的出现频次用不同颜色表示图3 角蛋白Keratin 34的热图Fig.3 Heat maps of Keratin 34

图4 肽段(G69-R82)(a)的鉴定图和Keratin 34中的肽段分布图(b)Fig.4 Identification of a hydrolysis peptide (G69-R82) (a) and sequence of Keratin 34 and the distribution of identified peptides (b)

3 结论

角类动物药的临床使用不可或缺，近年来的研究表明，山羊角作为羚羊角的替代资源应用广泛，且功效确切。根据传统民间儿科验方“羚羊清肺散”开发的现代中药“金振口服液”，工业生产以山羊角替代羚羊角制备而成，经临床验证，以羚羊角和以山羊角制备的金振口服液均具有良好的解热、抗炎作用和清热解毒、祛痰止咳的功效[4]。

山羊角水提液中主要含有的蛋白质类、肽类物质为角蛋白、胶原蛋白、角蛋白相关蛋白等的降解产物，这些蛋白质属于结构蛋白，在动物表皮、蹄甲、角质等组织中含量丰富，角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，是动物体毛发、蹄甲、角、鳞片等的重要组成成分，具有保护机体的作用；胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白，是动物结缔组织中的主要成分；桥粒蛋白是细胞骨架的组成部分，参与细胞的角质形成。山羊角在高温煎煮条件下，蛋白分子间或分子内的二硫键断裂、水解，会有部分角蛋白或胶原蛋白溶出，并可能与多肽形成混合物，这些混合多肽为非特异性降解的产物[11]。山羊角水提液中的混合多肽成分，如肽段VKARLESEINTYRG、RLESEINTYRG、TYRGLLDSE和SKLPSNP-CATTN等，均源于角蛋白Keratin 34(E3VW79_SHEEP)的C末端肽段V361-N392，VKARLES-EINTYRGLLDSEDSKLPSNPCATTN只是裂解位点不同。

一直以来角类动物药的物质基础研究缺乏合适的方法学，本实验在前期研究基础上，建立了基于nano LC-LTQ/Orbitrap MS的shotgun技术分析山羊角中蛋白质多肽类物质的研究策略，可快速分析并鉴定山羊角水提液中混合蛋白质类、多肽类物质组成，其结果可为角类动物药，乃至中药动物药的蛋白质、肽类物质基础研究奠定基础。

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Analysis and Identification of Proteins and Peptides from Goat Horn (CapraeHircusCornu) Using nano LC-LTQ/Orbitrap MS

LIU Rui1,2,3, ZHU Zhen-hua1,3, QIAN Da-wei1,3, DUAN Jin-ao1,3

(1.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization,NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China;2.JiangsuKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentinMarineBio-resourcePharmaceutics,Nanjing210023,China;3.JiangsuKeyLaboratoryforHighTechnologyResearchofTCMFormulae,Nanjing210023,China)

The objective of the present study was to study the proteins and peptides of goat horn (CapraeHircusCornu, GH) based on the shotgun strategy. By using LTQ/Orbitrap MS, proteins and peptides were identified from GH aqueous extract. In total, 52 proteins were identified from GH fraction with the molecular weight larger than 3 ku, and 1 288 peptides were identified from GH fraction with the molecular weight lower than 3 ku, and these peptides were hydrolyzed from 46 proteins. The identified proteins were keratin, collagen, keratin-associated protein, etc. It can be speculated that the particular “hot regions” in the amino acid sequence which were easier to proteolysis, drop, dissolve and generate a number of peptides. According to the present strategy, proteins and peptides derived from GH aqueous extract can be rapid and efficient identified. The strategy can be applied in analysis and identification of proteins in animal horn derived TCMs, and provide a reference for investigate the material basis of animal horn derived TCMs.

goat horn (CapraeHircusCornu, GH); protein; peptides; shotgun; identification

2016-11-16;

2016-12-26

国家自然科学基金项目(81202861，81274017)；江苏高校优势学科建设工程项目(PAPD)；江苏省高校“青蓝工程”优秀青年骨干教师项目(2016年)；江苏省“333工程”第三层次项目(2016年)资助

刘 睿(1982—)，男(汉族)，南京人，副研究员，从事中药动物药物质基础研究。E-mail: cpulr@126.com

段金廒(1956—)，男(汉族)，宁夏中卫人，教授，从事中药资源化学研究。E-mail: dja@njucm.edu.cn

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0109-07

10.7538/zpxb.2017.38.01.0109