毛细管气相色谱法测定水杯密封垫圈中N-亚硝胺的迁移量

严拯宇，牛倩倩，牟明瑶，刘廷生，曹志然，廖声华

（1.中国药科大学理学院，江苏 南京 211198；2.中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 211198）

毛细管气相色谱法测定水杯密封垫圈中N-亚硝胺的迁移量

严拯宇1，牛倩倩1，牟明瑶1，刘廷生2，曹志然2，廖声华1

（1.中国药科大学理学院，江苏 南京 211198；2.中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 211198）

建立毛细管气相色谱法用于测定水杯密封垫圈中5种N-亚硝胺的迁移量。采用DB-5（30m×0.53mm，1.00μm）毛细管柱；程序升温：38℃保持4min，以15℃/min的速率升至250℃保持4min；N2为载气，流量为4.0mL/min；氢火焰离子化检测器（FID），检测器温度为250℃；进样口温度为280℃；进样量为1.0μL。以2-叔丁基对甲酚为内标，通过内标对比法计算样品中5种N-亚硝胺的迁移量。在该色谱条件下，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二丁胺之间均能完全分离。此5种N-亚硝胺化合物分别在0.01～0.50，0.10～0.75，0.02～0.75，0.02～0.75，0.01～0.50mg/kg的质量浓度范围内线性关系良好（r2=0.9916～0.9955）；进样精密度（RSD）均小于5.0%（n=6）；平均回收率为88.9%～96.7%（RSD＜5.0%，n=9）。定量限分别为0.01，0.10，0.02，0.02，0.01 mg/kg（信噪比为10∶1）；检测限分别为2.0，20，2.0，2.0，2.0 μg/kg（信噪比为3∶1）。采用本法测定3个厂家各2批水杯垫圈中N-亚硝胺的迁移量，均低于规定限度。该方法简便、准确、灵敏、重复性好、成本低，可用于水杯垫圈中N-亚硝胺迁移量的检测。

毛细管气相色谱法；N-亚硝胺；迁移量；水杯垫圈

0 引 言

N-亚硝胺是一类对人体有强致癌作用的N-亚硝基化合物，广泛存在于腌制食品、烟熏食品及一些乳胶制品中，如气球[1]、婴幼儿奶嘴[2]、医用手套[3]、玩具[4]等。基于N-亚硝胺对人体的强致癌作用，各国陆续颁布了关于N-亚硝胺限量的规定或指令，如1993年欧盟颁布的《关于弹性体或橡胶奶嘴和安抚奶嘴中释放的N-亚硝胺和N-亚硝基化合物》指令中规定了由弹性体或橡胶所制成的奶嘴和安抚奶嘴中N-亚硝胺的迁移量的合格限量[2]。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局与中国国家标准化管理委员会于2009年联合发布的GB/T 24153——2009《橡胶及弹性体材料 N-亚硝基胺的测定》[5]中规定了采用气相色谱-质量选择检测器（GC-MSD）测定橡胶及弹性体材料中12种N-亚硝胺含量的方法，该方法的检测限为0.5mg/kg。

近年来，对N-亚硝胺化合物测定的方法不胜枚举。2013年，杨荣静等[6]用气相色谱-正化学电离质谱法检测婴儿奶嘴中N-亚硝胺物质的迁移量。同年，杨宁等[7]采用双填料固相萃取-高效液相色谱/质谱法同时检测了腌菜中9种N-亚硝胺。2015年，王亚恩等[8]采用气相色谱-正化学源离子阱质谱法测定了饮用水中9种N-亚硝胺。上述方法均具有快速准确、灵敏度高的特点，但是，由于需要使用质谱仪等仪器，因而价格昂贵。

为了降低检测成本，本研究采用了气相色谱法测定水杯密封垫圈中的N-亚硝胺的迁移量，此法简便、准确度高、成本低廉，适用于常规的水杯密封垫圈的质量检测。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

气相色谱仪：安捷伦N6890气相色谱仪，Agilent Chemstation工作站、FID检测器；BP211D电子天平（北京赛多利斯公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 药品和试剂

样品水杯杯垫，1号厂家，批号141011，150111；2号厂家，批号 151002，151105；3号厂家，批号141209，141230）。

C18固相萃取小柱（安捷伦科技有限公司，10 mg/mL）；二氯甲烷 （国药集团化学试剂有限公司，纯度99.5%）；甲醇（江苏汉邦科技有限公司，纯度99.95%）；无水硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司，纯度99.0%）；2-叔丁基对甲酚（上海百灵威科技有限公司，纯度98%）；N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二丁胺5种N-亚硝胺对照品均来源于上海百灵威科技有限公司，质量浓度为100 μg/mL，溶剂为二氯甲烷；实验用水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DB-5（30 m×0.53 mm，1.00 μm）；程序升温：初始温度38℃保持4 min，以15℃/min的速率升至250℃并保持4 min；检测器温度为250℃；进样口温度为280℃；载气为氮气，流量4.0mL/min；燃气为氢气，流量40.0mL/min；助燃气为空气，流量450.0mL/min；进样体积为1.0μL。

2.2 溶液的制备

各对照品储备液的制备：分别取5种N-亚硝胺对照品（100μg/mL）适量置于10mL量瓶中，即得各对照品储备液（100μg/mL）。

0.5 mg/mL内标储备液的配制：精密称定 2-叔丁基对甲酚25.000 mg，置于50 mL容量瓶中，加入二氯甲烷适量溶解并定容，混匀后作为内标储备液。

混合对照品储备液的配制：精密量取各对照品储备液0.10mL，置于1mL容量瓶中，加二氯甲烷稀释、定容，即得各对照品质量浓度均为10 μg/mL的混合对照品储备液。

混合对照溶液的配制：精密量取混合对照品储备液0.10 mL置于1 mL容量瓶中，加入内标储备液0.10mL后用二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，即可。

为了模拟水杯密封垫圈中N-亚硝胺化合物的迁移，在杨荣静等[9]测定婴儿奶嘴中N-亚硝胺的迁移量时对婴儿奶嘴的前处理基础上，考虑到实际生活中水杯密封垫圈N-亚硝胺化合物的迁移介质大多为饮用水，故确定了供试品溶液的配制方法如下：取完整的水杯垫圈约20 g，放入装有纯水的烧杯中，使纯水正好覆盖住样品，浸泡10min。取出试样，使试样自然风干，得到去除非橡胶类物质的试样。准确称取10g上述试样，置于200mL具磨口塞的锥形瓶中，加入40mL沸水，使液体覆盖住试样，塞好瓶塞，避光自然冷却，放置2h。将提取液倒入干净的50mL棕色容量瓶中，用纯水洗涤试样，洗涤液并入提取液中，用纯水定容，混匀，即得提取液。

用2mL二氯甲烷、2 mL甲醇和5 mL水依次处理C18固相萃取小柱。将上述提取液上样，控制流速，待样品全部通过固相萃取小柱后，低真空抽干10min。用10mL二氯甲烷分5次洗涤样品容器，并淋洗小柱，收集淋洗液。将淋洗液以无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪浓缩至0.8mL，并用二氯甲烷定容至1mL后待测。

2.3 专属性试验

精密量取空白溶剂（二氯甲烷）、各对照品及内标2-叔丁基对甲酚的储备液适量，按2.1项下色谱条件，分别进样测定，记录色谱图，确定其保留时间。结果如图1所示，在该色谱条件下，空白溶剂对上述N-亚硝胺化合物的测定无干扰，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶、N-亚硝基二丁胺及内标的保留时间分别为5.782，8.019，10.195，10.647，12.149，12.912min。

图1 空白溶剂和混合对照溶液的色谱图

2.4 系统适用性试验

精密量取混合对照溶液和空白溶剂（二氯甲烷）1.0 μL，按2.1项下色谱条件，分别进样重复测定6次，如表1～表6所示，混合对照溶液中各对照品及2-叔丁基对甲酚的理论塔板数均大于5 000，各相邻组分的分离度均大于1.5，均能完全分离，且溶剂不干扰测定，各组分的峰面积RSD在4.56%～9.32%之间。

表1 N-亚硝基二甲胺系统适用性试验

表2 N-亚硝基二乙胺系统适用性试验

2.5 线性考察

分别精密量取混合对照品储备液10.0，20.0，100.0，150.0，250.0，500.0，750.0 μL置于1 mL容量瓶中，各加入内标储备液100.0μL，用二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，作为系列标准溶液（编号1#～7#）。精密量取各标准溶液1.0μL，进样，记录色谱图，以各组分与内标的峰面积比值（A）与相应质量浓度（C，mg/kg）进行线性回归。结果如表7所示，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二丁胺分别在0.01～0.50，0.10～0.75，0.02～0.75，0.02～0.75，0.01～0.50 mg/kg的范围内线性良好，其线性相关系数分别为0.9945，0.9936，0.9955，0.9939，0.9916，线性方程分别为A=2.4926C-0.0331（n=6）、A=1.0386C-0.0732（n=6）、A=4.0754C-0.1741（n=6）和A=1.1279C-0.0318（n=6）、A=0.4826C+0.0041（n=6）。

表3 N-亚硝基吗啉系统适用性试验

表4 N-亚硝基哌啶系统适用性试验

表5 N-亚硝基二丁胺系统适用性试验

表6 2-叔丁基对甲酚系统适用性试验

2.6 重复性试验

取2.5项下制备的系列标准溶液中6#溶液，精密量取1.0μL，连续进样测定6次，记录色谱图。另取水杯密封垫圈（1号厂家，批号141011）6份，按2.2项下方法，制备6份供试品溶液，分别进样，记录色谱图，按内标对比法计算各组分的迁移量。首先按2.2项下混合对照溶液的配制方法，配制含有内标物及待测物对照品的校正因子测定用对照溶液，进行分析，计算校正因子（f）：

表7 5种N-亚硝胺的回归方程与线性范围

式中：As——内标的峰面积；

AR——待测物对照品的峰面积；

Cs——内标的质量浓度；

CR——待测物对照品的质量浓度。

再取样品配制含有内标的供试品溶液进行分析，计算质量浓度（Cx）：

式中：Ax——供试品溶液的待测物峰面积；

Cx——供试品溶液的待测物质量浓度。

结果如表8所示，N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二丁胺均未检出，N-亚硝基二甲胺的平均质量浓度为0.01387mg/kg，RSD为0.13%。

表8 重复性试验结果（n=6）1）

2.7 定量限和检测限

取各溶剂对照品储备液适量，用二氯甲烷逐级稀释后，精密量取1.0μL，进样测定。以信噪比（S/N）为3时的质量浓度确定检测限，以信噪比（S/N）为10时的质量浓度确定定量限。结果如表9所示，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二丁胺的定量限分别为0.010，0.100，0.020，0.020，0.010 mg/kg；N-亚硝基二乙胺的检测限为20μg/kg，其余N-亚硝胺化合物的检测限均为2.0μg/kg。

表9 定量限与检测限考察结果

2.8 回收率试验

取水杯密封杯垫（1号厂家，批号141011）10g若干份，精密称定，按2.2项下方法制备提取液，再向提取液中分别加入0.50，1.00，1.50 μg/mL的各对照组分，加入适量内标储备液，再按2.2项下方法萃取、浓缩得到低、中、高3个浓度水平的供试品溶液，每个水平配制3份，进样，记录色谱图，计算回收率。结果如表10所示，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二丁胺的平均回收率分别为93.8%、88.9%、96.7%、93.7%和95.0%，RSD分别为4.84%、4.22%、4.45%、3.34%和4.90%。

表10 5种N-亚硝胺的回收率试验结果 %

2.9 样品测定

取3个厂家共6个批次的水杯密封垫圈，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，进样，记录色谱图，按内标法计算各组分的残留量。结果如表11所示，3个厂家6个批次的水杯密封垫圈中均未检出N-亚硝基二乙胺和N-亚硝基吗啉，N-亚硝基二丁胺、N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基哌啶的质量浓度均符合GB/T 24153——2009[5]中的规定。

表11 3个厂家6个批次水杯密封用垫圈中N-亚硝胺迁移量检测结果 mg/kg

3 结束语

本文采用毛细管气相色谱法测定水杯密封垫圈中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二丁胺5种代表性的N-亚硝胺迁移量。研究表明，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二丁胺分别在0.01～0.50，0.10～0.75，0.02～0.75，0.02～0.75，0.01～0.50 mg/kg的质量浓度范围内线性关系良好，线性相关系数分别为0.9945，0.9936，0.9955，0.9939，0.9916；平均回收率分别为93.8%、88.9%、96.7%、93.7%和95.0%；定量限分别为0.01，0.10，0.02，0.02，0.01 mg/kg（信噪比为10∶1）；检测限分别为2.0，20，2.0，2.0，2.0μg/kg（信噪比为3∶1）。与已有N-亚硝胺化合物的检测方法[3-6]相比，本方法使用的仪器（安捷伦N6890气相色谱仪）常见、检测成本低廉，且检测快速、灵敏，操作简便，结果准确、可靠、重复性好。综上所述，本文建立的毛细管气相色谱法可用于检测水杯密封垫圈中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二丁胺5种代表性的N-亚硝胺迁移量，确保饮水安全。

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（编辑：莫婕）

Determination of migration levels of N-nitrosamines in cup gasket by capillary GC

YAN Zhengyu1，NIU Qianqian1，MOU Mingyao1，LIU Tingsheng2，CAO Zhiran2，LIAO Shenghua1
（1.School of Science，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China；2.School of Life Science and Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

To establish a capillary GC method for simultaneous determination of migration levels of 5 N-nitrosamines in cup gasket.Methods DB-5 capillary column（30 m×0.53 mm，1.00 μm）was selected as chromatographic column，the initial temperature of which was 38℃ for 4 min and gradually reached to 250℃ for 4 min with the rate of 15℃/min.Nitrogen was selected as carrier gas at a flow rate of 4.0 mL/min and FID was used to detect N-nitrosamines at 250℃.The temperature of injection chamber was set at 280℃ and the volume of injection was 1.0 μL.2-tert-butyl-p-cresol was used as internal standard compound，five kinds of component in the samples were calculated by internal standard comparison method.N-nitrosodimethylamine，N-nitrosodiethylamine，N-nitrosomorpholine，N-nitrosopiperidine and N-nitrosodi-n-butylamine were completely separated under the established chromatographic condition.Good linear relationship were obtained for these five N-nitrosamines in the range of 0.01-0.50，0.10-0.75，0.02-0.75，0.02-0.75，0.01-0.50mg/kg，respectively.The correlation coefficients of these five kinds of N-nitrosamines were ranged from 0.9916 to 0.9955.The relative standard deviation of sampling precisions were less than 5.0%（n=6）and the average recovery were ranged from 88.9%to 96.7%（RSD＜5.0%，n=9）.The limits of quantification for them were 0.01，0.10，0.02，0.02 and 0.01mg/kg respectively（S/N=10∶1）.The limits of detection for them were 2.0，20，2.0，2.0 and 2.0μg/kg respectively（S/N=3∶1）.The migration levels of these five kinds of N-nitrosamines in the samples were lower than the limit of regulation in the samples.The method is simple，accurate，sensitive，repeatable and low cost.It is suitable for the determination of the migration levels of 5 N-nitrosamines in cup gasket.

capillary GC；N-nitrosamines；migration level；cup gasket

A

：1674-5124（2017）01-0037-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.01.008

2016-05-20；

：2016-07-19

大学生创新药物研制能力提高项目（J1030830）国家级大学生创新创业训练计划项目（G15019）

严拯宇（1955-），女，河南开封市人，教授，博士生导师，主要从事仪器分析、药物分析方面的研究。