电针对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响

范茜茜 董 勤 沈梅红 李 茜 赵小文 吴锦萍

(南京中医药大学第二临床医学院，江苏 南京 210046)

·基础研究·

电针对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响

范茜茜 董 勤 沈梅红 李 茜 赵小文 吴锦萍

(南京中医药大学第二临床医学院，江苏 南京 210046)

目的 探讨电针对脑缺血再灌注大鼠皮质细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及其mRNA表达的影响。方法 雄性清洁级SD大鼠72只，采用随机数字表法分为假手术组、模型组和电针组各24只。用改良Longa线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉脑缺血模型，缺血2 h，于再灌注开始后电针组针刺“百会”和“大椎”穴。各组于缺血再灌注24 h后行神经行为学评分和脑含水量测定，免疫组化染色法检测缺损侧皮层组织Bcl-2、Bax的蛋白表达，qRT-PCR检测Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达的变化。结果 模型组、电针组神经行为学评分均低于假手术组(P<0.01),与模型组比较，电针组的神经行为学评分升高(P<0.05)。与假手术组比较，模型组脑含水量明显增高(P<0.01)，电针组的差异无统计学意义(P>0.05),较之模型组，电针组的脑含水量显蓍降低(P<0.01)。与假手术组比较，模型组、电针组Bcl-2蛋白及mRNA的表达均显著增多(P<0.05或P<0.01)，电针组又高于模型组(P<0.05)；较之假手术组，模型组Bax蛋白及mRNA表达显著上升(P<0.01)，电针组无明显差异(P>0.05)，电针组较模型组显著降低(P<0.01)；Bcl-2/Bax及Bcl-2 mRNA/Baxm RNA的比值，模型组降低而电针组升高(P<0.01)。结论 电针可以通过提升Bcl-2/Bax的比值使抗凋亡基因占据优势，从而抑制缺血再灌注区的细胞凋亡，减轻脑水肿，促进神经功能恢复。

电针；脑缺血再灌注；细胞凋亡；Bcl-2；Bax

神经细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤的病理过程中起重要作用，缺血性脑卒中神经细胞损害的重要机制，从基因分子学来看，神经元凋亡最重要的调节者是两个分子家族——半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族和Bcl-2蛋白家族。目前，Bcl-2和Bax在脑缺血再灌注RKM WTL 与细胞凋亡中的作用受到广泛关注，针刺对Bcl-2家族中的Bcl-2有促进其表达的作用，对Bax有抑制其表达的作用。本研究以此为切入点，结合神经行为学评分、脑组织含水量的改变等指标，进一步综合探讨针刺的调控特点，为针刺治疗缺血性脑中风的效应机制提供更丰富的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性清洁级SD大鼠72只，体重(280±20)g，购自北京维通利华动物实验中心〔许可证号SCXK(京)2012-0001〕。所有大鼠饲养于南京中医药大学动物中心〔12 h/12 h昼夜节律、(22±2)℃室温、50%～60%湿度，通风良好〕。适应性饲养1 w，大鼠自由摄食与饮水。采用随机数字表法随机抽取24只为假手术组，余下动物采用改良Longa线栓法构建脑缺血再灌注模型。将造模成功的大鼠按照随机数字表进行随机分组，分别为再灌注24 h组(下称模型组)，再灌注24 h+电针组(下称电针组)，每组有效例数为24只。

1.2 主要仪器与试剂 华佗牌一次性毫针，规格0.20×13 mm2(苏州医疗用品厂有限公司)、韩氏HANS-200型电针仪(南京济生医疗有限公司)；石蜡切片机RM2145(德国LEICA公司)；TP1020型生物组织烘片机(德国LEICA公司)；干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；荧光多功能显微镜BX60(日本OLYMPUS公司)；图像分析仪(CMIAS 98A，北京航空航天大学)；DP71图像获取系统(日本OLYMPUS公司)；核酸蛋白检测仪(德国Eppendorf公司)；Verity 96孔板热循环仪(美国Applied Biosystems公司)；PCR扩增仪7500(美国Applied Biosystems公司)。兔抗大鼠单克隆抗体Bcl-2(ab7973)、Bax(ab32503)一抗(上海Abcam贸易有限公司)；5%BSA胎牛血清(封闭液)、生物素化羊抗兔IgG(二抗)、链酶亲和素-生物素复合物(SABC)及二氨基联苯胺(DAB)显色液(武汉博士德生物工程有限公司)；RT-PCR反转录试剂盒(大连TaKaRa生物公司)。

1.3 局灶性脑缺血模型制备 采用改良Longa线栓法制备脑缺血再灌注模型〔1〕。选择直径为0.28 mm的鱼线，头端加热使其变成光滑球面(直径约0.30 mm)，然后剪成长约(60±0.5)mm线栓，用直尺将其平均分为三等分(每份约20 mm±0.5 mm)，75%的酒精清洁处理后备用。将大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后仰位固定，颈部备皮，铺孔巾后切开皮肤，分离右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。结扎剪断颈外动脉后，通过颈外动脉远心残端缓慢插入线栓,经颈内动脉进入大脑中动脉，插入深度约为(18±1.5)mm，当遇到一定阻力时立即停止插线，此时线栓头端已到达大脑中动脉的入口。将线栓入口处结扎固定，防止线栓脱落出血，缝合皮肤并消毒，外留1 cm线栓，将大鼠单独仰卧在鼠笼中。大鼠缺血2 h后轻轻拔出线栓，实现缺血再灌注。大鼠清醒后自由饮水和摄食。所有大鼠在术前禁食12 h，但自由饮水。

1.4 各组处理方法 假手术组：除不穿入线栓外，其余操作与模型组相同。模型组：采用改良Longa线栓法制备，缺血2 h后拔出线栓，模型建立后不进行任何干预处理。电针组：建立模型，缺血2 h后拔出线栓再灌注同时电针“百会”、“大椎”穴。参照《实验针灸学》〔2〕动物穴位图谱选取“百会”、“大椎”穴，用0.20 mm×13 mm的一次性不锈钢毫针针刺，“百会”穴平刺，“大椎”穴约30°角斜刺，深度为10 mm。接韩氏HANS-200型电针仪，“百会”穴接负极，“大椎”穴接正极。刺激参数：疏密波，频率2/15 Hz，刺激强度以针柄轻微颤动，且动物不嘶叫为宜。持续电刺激30 min。

1.5 观测指标 大鼠缺血2 h再灌注24 h后给予神经行为学评分，然后断头处死，其中8只行脑组织含水量测定;8只经4%多聚甲醛心脏灌流后取脑，行免疫组化检测;另8只取损伤灶周边组织，液氮速冻，-70℃冰箱保存，行qRT-PCR检测。

1.5.1 神经行为学评分 脑缺血再灌注24 h后，参照Julio氏18分制〔3〕评分法进行大鼠的神经功能行为学评分，标准：①自发活动(0～3分)，在大鼠笼中观察5 min，观察其靠近笼壁及探究环境的能力；②提尾观察四肢运动的对称性(0～3分)；③将大鼠置于桌子边缘，保持后腿腾空，观察两前肢运动的对称性(0～3分)；④观察攀爬能力，提尾拉下时感受其攀附力(1～3)；⑤本体感觉(1～3)，用钝棒触摸其两侧，观察其对刺激的反应；⑥触须反应(1～3)，从动物后面用钝棒触胡须，观察其反应，6项评分相加为总积分，评分范围3～18分，18分为正常。

1.5.2 脑含水量测定 采用干湿重称量法计算。实验动物再灌注24 h后断头取脑，用滤纸吸尽表面血渍后，去除嗅球、小脑和低位脑干，锐性刀片分离左右半球，将损伤侧半球的脑组织用电子分析天平称其湿重后，置于105℃恒温干燥箱内持续干燥24 h后称其干重，按照公式：脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%，计算脑组织含水量。

1.5.3 缺损侧大脑皮层Bcl-2、Bax蛋白表达 采用免疫组化法检测。大鼠经10%水合氯醛麻醉后，经左心室依次使用0.9%氯化钠盐溶液250 ml和250 ml 4%多聚甲醛溶液灌注固定到大鼠身体发僵后，迅速断头取出脑组织标本。脑组织标本保存于4℃的10%中性甲醛溶液中。24 h后依次从低浓度到高浓度的乙醇溶液中逐渐脱去脑组织中的水分，并使用二甲苯透明，最后石蜡包埋。在大鼠缺损侧大脑半球距离嗅球尖端7～11 mm处连续切取约6 μm厚脑组织切片，石蜡切片经常规脱蜡、水化后，滴加Bcl-2、Bax一抗，按试剂盒说明常规SABC法对切片标本进行染色，DAB显色，蒸馏水洗、脱水、透明、封片。染色结果阳性细胞为黄色或黄棕色。将已染好的切片放在荧光多功能显微镜40×10倍视野下随机选择不重叠缺损侧顶颞区皮层的5个视野观察Bcl-2、Bax的阳性表达，用图像分析软件计算阳性细胞的积分光密度值(IOD)，所得数据取其均值。

1.5.4 缺损侧大脑皮层Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达 采用qRT-PCR法进行检测。大鼠缺血再灌注24 h后，在冰盘上迅速分离梗死侧皮层，经液氮包埋速冻。置于-80℃低温冰箱中保存。经总RNA提取，逆转录合成cDNA后，进行PCR反应。反应条件：95℃ 预变性2 min；95℃ 变性15 s，55℃退火延伸35 s，扩增40个循环；72℃ 5 min。55℃ 35 s读取荧光强度。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 电针对脑缺血再灌注大鼠神经功能行为学评分的影响 脑缺血再灌注24 h后，模型组〔(9.25±1.71)分〕、电针组〔(12.00±1.58)分〕神经行为学评分均低于假手术组〔(15.10±1.52)分〕(均P<0.01)；与模型组比较，电针组的神经行为学评分升高(P<0.05)。

2.2 电针对脑缺血再灌注大鼠脑含水量的影响 与假手术组〔(79.49±0.94)%〕比较，再灌注24 h后模型组脑含水量〔(81.88±1.84)%〕明显增高(P<0.01)，而电针组〔(79.75±1.11)%〕与假手术组之间差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，电针组的脑含水量显著降低(P<0.01)。

2.3 电针对脑缺血再灌注大鼠大脑皮层Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组、电针组再灌注24 h后Bcl-2蛋白表达均显著增多(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，电针组水平升高(P<0.05)。与假手术组比较，模型组Bax蛋白表达明显上升(P<0.01)，而电针组略有升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，电针组Bax蛋白表达较低(P<0.01)。与假手术组比较，模型组Bcl-2/Bax蛋白比值降低，电针组比值升高(P<0.01)，电针组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠大脑皮层组织Bcl-2、Bax 蛋白表达的比较

与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.01

2.5 电针对脑缺血再灌注大鼠大脑皮层Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达的影响 与假手术组比较，模型组、电针组Bcl-2 mRNA表达均显著增多(P<0.05和P<0.01)；与模型组比较，电针组Bcl-2 mRNA表达略有升高，无统计学差异(P>0.05)。与假手术组比较，模型组Bax mRNA的表达明显上升(P<0.05)，而电针组无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，电针组Bax mRNA的表达降低(P<0.05)。与假手术组比较，模型组Bcl-2/Bax mRNA的比值降低，而电针组比值升高(P<0.05和P<0.01)；电针组与模型组比较亦有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠皮层组织Bcl-2 mRNA、 Bax mRNA表达的变化

与假手术组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较:3)P<0.05，4)P<0.01

3 讨 论

参与细胞凋亡调节的内部因子很多，而Bcl-2家族相关基因是脑缺血神经元凋亡调控基因的重要组成部分。目前已知的凋亡调节蛋白中Bcl-2家族在各类刺激信号引起的凋亡中起到关键的作用〔4〕。Bcl-2蛋白家族包括两类功能相反的基因，一类是抑制细胞凋亡的基因，以 Bcl-2为代表；另一类是促进细胞凋亡，以Bax为代表，它与Bcl-2具有较高的同源性，可以拮抗Bcl-2的凋亡抑制作用，诱导细胞凋亡。

脑缺血损伤后伤侧大脑广泛存在凋亡现象，以皮层及海马为甚,大脑皮层是创伤损伤部位,神经元对外源刺激因素较敏感,可发生细胞坏死〔5〕。杨云华等〔5〕研究发现，Bcl-2、Bax基因在伤脑表达增高，其增高的时相与凋亡规律相似，表达与细胞凋亡发生呈正相关。说明在伤后的大脑中，Bcl-2、Bax基因处于矛盾的交争中，当Bax诱导脑细胞调亡时，大脑的自我修复系统同时启动Bcl-2抑制细胞凋亡途径，最大可能减轻脑神经元的损害。Bax和Bc1-2表达比率是决定细胞是否会发生凋亡的重要因素。韩英等〔6〕实验中观察到，Bax在脑缺血损伤再灌注时表达增加，与Bcl-2形成同源二聚体促进细胞凋亡，同时在邻近半暗带生存神经元Bcl-2表达的上调反映了一种保护作用，但缺血再灌注组Bcl-2/Bax比值降低，终致凋亡细胞增加。可见，二者表达的相对水平高低与凋亡调控直接相关。

针刺能明显提高Bcl-2 表达，同时降低Bax 表达。如陶静等〔7〕于脑缺血再灌注2 h后开始电针患侧“曲池”、“足三里”穴，24 h后检测表明，Bcl-2 表达增高，Bax 表达下降，从而对抗脑缺血再灌注损伤所致的细胞凋亡起到抗凋亡的脑保护作用。何娜等〔8〕观察大鼠脑缺血再灌注模型建立后针刺外关、足三里后细胞凋亡蛋白的变化，针刺组Bcl-2的表达明显高于假手术组，Bax的表达与假手术组基本相似，证明针刺治疗脑梗死可升高Bcl-2和降低Bax的表达，从而抑制脑细胞的凋亡，改善神经功能。

本研究结果显示，在脑缺血后神经细胞凋亡过程中，Bcl-2蛋白与Bax 蛋白二者表达的平衡结果决定细胞存活或死亡，电针可以通过调控内源性凋亡途径促进抗细胞凋亡基因Bcl-2的作用，抑制Bax的促凋亡作用，但并非单纯表现为升高Bcl-2或降低Bax的绝对值，关键在于提升Bcl-2/Bax的比值，使抗凋亡基因占据优势，从而达到降低缺血再灌注区的细胞凋亡、减轻脑水肿、促进神经功能恢复的目的。

1 李忠仁,崔 龙.“TC”指数在改良LONGA线栓法局灶性脑缺血/再灌流动物模型制备中的应用〔J〕.中国中西医结合杂志,2006;26(91):18-20.

2 余曙光，徐 斌.实验针灸学〔M〕.北京:人民卫生出版社，2012:277.

3 Garcia JH,Wagner S,Liu KF,etal.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats〔J〕.Stroke,1995;26(4):627-35.

4 Babu PP,Suzuki G,Ono Y,etal.Attenuation of ischemia and/or reperfusion injury during myocardial infarction using mild hypothermia in rats:an immunohistochemical study of Bcl-2,Bax,Bak and TUNEL〔J〕.Pathol Int,2004;54(12):896-903.

5 杨云华,张可成,张艺梅.大鼠脑创伤细胞凋亡和Bcl-2基因家族表达的变化〔J〕.西南国防医药,2009;19(5):488-91.

6 韩 英,刘 楠,陈荣华,等.大鼠脑缺血再灌注损伤后的细胞凋亡与Bcl-2、Bax的表达〔J〕.中国临床神经科学,2006;14(1):15-9.

7 陶 静,陈阿贞,兰 岚,等.电针对大鼠早期局灶性脑缺血再灌注损伤细胞凋亡机制的研究〔J〕.中国康复医学杂志,2014;29(1):3-8.

8 何 娜,朱春雷,何 欣.针刺治疗脑梗死对神经元保护作用机制的实验研究〔J〕.当代医学,2012;18(9):3-4.

〔2016-06-20修回〕

(编辑 袁左鸣)

Influence of electroacupuncture on the expression of apoptosis related genes Bcl-2 and Bax in rats with cerebral ischemia reperfusion injury

FAN Qian-Qian,DONG Qin,SHEN Mei-Hong,etal.

The Second Clinical Medical College of Nan Jing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,Jiangsu,China

Objective To observe the influence of electroacupuncture(EA) on the expression of apoptosis related protein Bcl-2,Bax and mRNA in rats with cerebral ischemia and reperfusion.Methods The male 72 grade clean SD rats,using the random number table method ,were divided into sham operation, model and EA groups with 24 rats in each group.The right middle cerebral artery occlusion models were induced by modified Longa suture method,and 2 hours later,EA group after reperfusion was given acupuncture "Baihui" and "Dazhui".The neurological behavior score and brain water content were measured by 24 hours after ischemia and reperfusion. The immunohistochemical staining method was used to detect defects of lateral cortex tissue Bcl-2, Bax protein expression. qRT-PCR was used to detect the changes of Bax and Bcl-2 mRNA expressions.Results The scores of neurological behavior in EA and model groups were lower than those in the sham operation group(P<0.01);Compared with that of model group,the neurological behavior score of EA group was increased(P<0.05).Compared with that of sham operation group,the brain water content was significantly increased in model group (P<0.01);However,there was no significant difference in EA group(P>0.05); Compared with that of model group, the brain water content of EA group was decreased noticeable(P<0.01). Compared with those of sham operation and model groups, the expressions of Bcl-2 protein and mRNA of EA group were significantly increased(P<0.05 orP<0.01), the expressions of Bax protein and mRNA Bax of model group were significantly increased(P<0.01). The ratio of Bcl-2 mRNA/Bax mRNA and Bcl-2/Bax of model group were decreased and those of EA group were increased(P<0.01).Conclusions EA could improve the ratio of Bcl-2/Bax to take advantage of the anti apoptotic gene and to inhibit the cell apoptosis, reduce the brain edema and promote the recovery of neural function.

EA;Cerebral ischemia reperfusion;Apoptosis;Bcl-2 gene;Bax gene

国家自然科学基金资助项目(81373748)

董 勤(1961-)，女，教授，硕士生导师，主要从事针灸临床研究。 沈梅红(1970-)，女，硕士生导师，主要从事针灸实验研究。

范茜茜(1991-)，女，硕士，主要从事电针对脑缺血再灌注损伤神经保护作用的凋亡机制研究。

R245

A

1005-9202(2017)05-1041-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.001