Notch1信号通路在胶质瘤中的作用机制

黄春波 张豪杰 杨瑞生 李庆安 王伟丰 靳晓亮 李同宽 霍宇飞 马燕然 胡金江

(济源市人民医院神经外科，河南 济源 459000)

Notch1信号通路在胶质瘤中的作用机制

黄春波 张豪杰1杨瑞生 李庆安 王伟丰 靳晓亮 李同宽 霍宇飞 马燕然 胡金江

(济源市人民医院神经外科，河南 济源 459000)

目的 探讨Notch1信号通路在人脑胶质瘤中的作用机制。方法 应用实时荧光量(real-time)PCR方法检测 50 例人脑胶质瘤标本和10例正常脑组织中的 Notch1及其下游靶基因Hes1以及增殖指标Ki-67及PCNA的 mRNA 表达。利用Western印迹检测Notch1的活化片段NICD的表达。结果 Notch1 mRNA 在人脑胶质瘤和正常脑组织中均可表达，但在人脑胶质瘤中的表达显著高于正常脑组织(P<0.01)，随着胶质瘤恶性程度的增高，Notch1及其下游靶基因Hes1的表达也随之升高，两者的变化趋势一致。Ki-67在胶质瘤中的表达升高，与正常脑组织对比差异显著(P<0.01)；PCNA在人脑胶质瘤中的表达同样升高，与正常脑组织对比差异显著(P<0.05)。结论 Notch1信号通路可能通过Hes1作用于胶质瘤细胞，促进细胞的增殖，进而参与到肿瘤的形成及恶化。

Notch1信号通路；人脑胶质瘤

脑胶质瘤作为中枢神经系统最常见的、预后很差的原发性恶性肿瘤，手术联合放、化疗的综合治疗后的胶质瘤病人极易复发，且容易产生对放化疗作用的抵抗。因此寻找更为有效的治疗方法至关重要。Notch1信号通路在正常组织中，可以参与细胞的增殖、转移，调节组织的修复，其受体在正常组织中广泛分布，可参与胚胎的发育、组织的生成〔1〕。在胶质瘤和髓母细胞瘤中Notch1信号通路异常激活。异常激活的Notch1信号通路促进恶性胶质瘤干细胞的细胞分化和血管化，促进胶质细胞恶化并通过促进血管化加速肿瘤的侵袭和转移〔2〕。Zhang等〔3〕研究发现Notch1信号通路可能参与胶质瘤细胞的侵袭和转移。临床流行病学发现Notch1可以作为胶质瘤的一个标志物分子〔4〕，在胶质瘤筛查中具有一定的作用。但是对于具体的Notch1信号通路在胶质瘤侵袭转移中的具体分子机制目前尚不清楚。本研究通过基因及蛋白水平检测 Notch1及其下游靶基因Hes1，在各级别人脑胶质瘤和正常脑组织的表达情况，分析其与胶质瘤病理级别的相关性，探讨Notch1在人脑胶质瘤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集济源市人民医院2012年2月至2015年9月手术切除的人脑胶质瘤新鲜标本50例，男 29 例，女 21 例，年龄 22～65岁，中位年龄43.5岁 。按2000年WHO脑肿瘤分类标准：Ⅰ～Ⅱ级(低度恶性胶质瘤)28 例； Ⅲ～Ⅳ级(高度恶性胶质瘤)22例。所有标本均为首次确诊，手术前未经任何化疗、放疗及其他免疫抑制治疗。通过内减压手术获得新鲜正常脑组织标本 10 例作为对照 。所有标本均冻存在-80℃冰箱内。主要试剂：Trizol购自美国Ambion公司；M-MLV逆转录试剂盒购自Invitrogen中国公司； 实时荧光定量PCR(real-time PCR)中的荧光染料iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix购自美国BIO-RAD公司；Western印迹检测所有蛋白抗体Notch1抗体及β-actin抗体均购自英国Abcam公司；蛋白二抗购自北京中山金桥公司；Notch1、Hes1级ki-67扩增引物均由Invitrogen公司合成。引物序列：ki-67上游引物：5′-GCACTCTCCGCTCAGTAAGTC-3′，下游引物：5′-GGCCTGATGTTTGGAAGACC-3′;PCNA上游引物：5′-GGCAGAGGGTTGGTAGATGT-3′,下游引物：5′-ACAAACATGGTGGCGGTGTT-3′；Notch1上游引物：5′-TTCGTGCTCCTGTTCTTTGTC-3′,下游引物：5′-GGGCTCTCTCCGCTTCTTG-3′；Hes1：上游引物：5′-CGACACCGGACAAACCAAT-3′，下游引物：5′-GAATGTCTGCCTTCTCCAGCTA-3′;β-actin：上游引物：5′-ATGTGGATCAGCAAGCAGGA-3′，下游引物：5′-AAGGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′。

1.2 方法

1.2.1 real-time PCR检测脑胶质瘤中Notch1、Hes1及ki-67基因表达水平 取-80℃冻存的组织，用TRIzol试剂提取RNA，M-MLV逆转录试剂盒反转录成cDNA，再用real-time PCR法检测Notch1、Hes1及ki-67的mRNA相对水平变化。

1.2.2 Western印迹检测组织中Notch1蛋白表达水平 取-80℃冻存的组织50 mg，研磨成细胞匀浆，加入组织裂解液500 μl和多种蛋白酶抑制剂混合液(cocktail)5 μl，冰浴；4℃ 12 000 r/min，离心10 min后取上清，采用Bradford法测定样品蛋白质的浓度。按照每泳道100 μg加样进行100 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，将蛋白质条带转移至硝酸纤维素膜(NC膜)；用含50 g/L脱脂奶粉的PBST(PBS+0.1%Tween-20)溶液封闭2 h后，加入Notch1抗体(1∶2 000)和β-actin(1∶5 000)一抗，4℃过夜；用PBST溶液洗膜3次，10 min/次。然后加入辣根过氧化物酶(HRP)-labeled(1∶20 000)二抗，室温避光孵育1 h，再用PBST溶液洗膜3次，10 min/次，然后用增强化学发光法(ECL)发光底物显影、定影、拍照。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 两组Notch1及Hes1 mRNA的表达水平 胶质瘤组中Notch1 mRNA水平(1.89±0.18)、Hes1 mRNA水平(1.44±0.15)均高于正常对照组(均为1)(均P<0.01)；且随着胶质瘤恶性程度的增高，Notch1及Hes1 mRNA水平也逐渐升高。Hes1的变化水平同Notch1一致。其中Ⅰ～Ⅱ级Notch1及Hes1 mRNA为1.68±0.28，1.29±0.16，Ⅲ～Ⅳ级为2.10±0.39，1.65±0.07。

2.2 两组ki-67及增殖细胞核抗原(PCNA)的mRNA水平比较 ki-67在胶质瘤组中表达(3.43±0.20)高于正常对照组(1)(P<0.05)。随着胶质瘤恶性程度的升高，ki-67的mRNA表达也逐渐升高(Ⅰ～Ⅱ级：2.84±0.13，Ⅲ～Ⅳ：4.01±0.91)。PCNA在人脑胶质瘤组中表达(2.19±0.54)高于正常对照组(1)(P<0.05)，且随着胶质瘤恶性程度的升高而升高(Ⅰ～Ⅱ级：2.01±0.72，Ⅲ～Ⅳ级：2.37±0.39)。

2.3 两组Notch1的蛋白水平比较 Western印迹结果同real-time PCR结果一致，胶质瘤组Notch1的活化片段NICD水平较正常脑组织组高，随着胶质瘤恶性程度的增高，NICD的表达增高。见图1。

1：正常脑组织2：Ⅰ级胶质瘤3：Ⅱ级胶质瘤4：Ⅲ级胶质瘤5：Ⅳ级胶质瘤 图1 两组Notch1活化片段NICD的变化水平

3 讨 论

胶质瘤死亡率较高，在国内颅内肿瘤中占44.69%〔5〕。胶质瘤主要分为星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和多形胶质母细胞瘤〔6〕。星形细胞瘤最常见。胶质母细胞瘤(Ⅳ级)有最高程度的恶性肿瘤和侵袭能力，占脑肿瘤的50%～60%〔7〕。多种癌基因和抑癌基因异常与胶质瘤的发生有关 。而肿瘤的生长、转移和预后均与肿瘤细胞的增殖相关。有研究显示Notch1信号通路可以参与到肿瘤细胞的增殖，而ki-67及PCNA是一种与增殖细胞相关的核抗原,是近年来认为更能有效评估肿瘤细胞增殖活性的重要标志物〔8〕。

Notch1信号通路的异常可以导致机体功能紊乱，致使肿瘤的发生；(NICD)是Notch1的活化片断；在Notch1信号通路中，当配、受体结合导致受体构象改变时，暴露出受体胞外域的肿瘤坏死因子-α-转化酶(TACE)金属蛋白酶切割位点，在TACE作用下，Notch胞外段发生切割，切割后游离的N端裂解片段(胞外区)被配体表达细胞内吞，而保留于受体细胞胞内的C端裂解片段则在γ-secretase的作用下进一步剪切，释放出游离于胞质中的Notch1受体活化形式(NICD/ICN),活化的NICD转移至细胞核内，可与转录抑制因子RBP-JK(也称为CSL/CBFl)结合，进而与共活化物Co-A(MAML、组蛋白乙酰基转移酶p300/CBP)结合后，即成为转录活化因子，活化Hes1等分化拮抗基因并募集Groucho/TLE等转录共抑制因子，阻碍细胞特异性分化效应基因的表达，最终影响细胞的分化、增殖和凋亡〔9〕。Hes1是一种转录抑制因子，可维持细胞未分化状态，使其保持足够增殖细胞数目，是Notch1的下游靶基因〔10〕。

本研究说明 Notch1的表达水平与人脑胶质瘤的病理级别相关，与人脑胶质瘤的恶性程度相关 。这与Yao等〔11〕的研究结果一致。本研究还发现Notch1信号通路在发挥作用时，是通过Hes1来向下传导的。总之，Notch1的表达及活化程度不仅与人脑胶质瘤的病理级别相关，同样与肿瘤的恶化程度有关。

胶质瘤恶性程度的病理分级是根据其血管化、局灶坏死程度和肿瘤细胞的增殖而决定的〔11〕。ki-67及PCNA不仅是细胞增殖常用的指标，同样是判断胶质瘤恶性程度及其预后的指标〔12〕。肿瘤增殖活性的检测对于判断其恶性程度、预见其生物学行为以及评估预后和选择适当的治疗措施意义重大。本研究推测,Notch1信号通路可能通过Hes1作用于胶质瘤细胞，促进细胞的增殖，进而参与到肿瘤的形成及恶化。以Notch1信号通路为靶点是临床研究的新进展及重大挑战。目前主要的干预有：(1)阻碍Notch受体的激活，包括γ-分泌酶抑制剂(GSIs)。(2)阻碍配体的结合包括单克隆抗体(mAbs)或者诱导剂(decoy)。(3)阻碍NICD的转录活性〔13〕。然而，由于Notch1表达的广泛性，也为治疗策略提出了更高的要求。

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13 Briot A,Iruela-Arispe ML.Blockade of specific NOTCH ligands:a new promising approach in cancer therapy〔J〕.Cancer Discov,2015;5(2):112-4.

〔2016-07-11修回〕

(编辑 袁左鸣)

河南省医学科技攻关计划项目(No.201403318)

黄春波(1982-)，男，主治医师，主要从事神经外科疾病研究。

R651

A

1005-9202(2017)05-1067-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.012

1 首都医科大学附属北京天坛医院基础医学院