大鼠脊髓损伤后自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达的变化

张 滨 黄旭明 张明兴 石艺华 陈碧珊

(广东药科大学附属第一医院康复医学科，广东 广州 510600)

大鼠脊髓损伤后自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达的变化

张 滨 黄旭明 张明兴 石艺华 陈碧珊

(广东药科大学附属第一医院康复医学科，广东 广州 510600)

目的 探讨大鼠脊髓损伤(SCI)后自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达变化对自噬发生的影响。方法 构建大鼠脊髓横断损伤模型，分别于损伤后0、4、12 h及1、3、5、7 d通过BBB评分评定SCI大鼠的行为学变化，同时经Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达；并通过腹腔注射自噬抑制剂3-MA和自噬促进剂Rapamycin于SCI小鼠模型，分别于上述时间点通过Western印迹进行Beclin1、LC3的检测，初步探讨自噬抑制剂和自噬促进剂在SCI后对自噬相关蛋白表达变化的作用。结果 随着大鼠SCI时间的延长，运动逐渐消失，SCI后3 d大鼠出现无运动现象，之后随着大鼠SCI时间的延长行为逐渐恢复；自噬相关蛋白Beclin1和 LC3的表达量随着SCI时间的延长逐渐升高，于3 d左右表达量显著升高(P<0.01)达到峰值；随后其表达量随SCI时间的延长呈现下降的趋势；Rapamycin作用大鼠后Beclin1和LC3的表达量与对照组相比显著增高，于3 d达到极显著水平(P<0.001)；3-MA作用大鼠后Beclin1和LC3的表达量与对照组相比显著降低(P<0.001)。结论 Rapamycin能够促进SCI后自噬相关蛋白Beclin1和 LC3的表达，最终引发自噬的发生，而3-MA能够抑制Beclin1和 LC3的表达，阻止SCI后自噬现象的发生。

脊髓损伤；自噬；Beclin1；LC3；Rapamycin；3-MA

脊髓损伤(SCI)包括原发性SCI和继发性SCI，继发性SCI除了加重SCI外，神经元水肿、变性和坏死现象也明显加重〔1〕。继发性SCI主要是由于神经元的凋亡及胶质细胞过度增殖，这一系列病理变化严重阻碍了轴突的再生，进而影响神经功能的恢复〔2〕。自噬作为生物进程中的一种动态现象，像LC3和Beclin1这些单纯自噬体表达的增多，并不能对自噬完全发生作很好的解释。不管是自噬体的融合机制被破坏还是相关溶酶体的失活都可以引发机体内自噬体的异常升高，但自噬活性却尚未激活〔3〕。完整自噬流的发生还需要对自噬底物像p62进行检测，理论上其表达量的高低与自噬现象的发生密切相关，随自噬的增强而呈下降趋势。只有当自噬底物的减少与自噬体的增多同时发生时才能证实自噬的发生。本研究在前人研究的基础上通过构建大鼠脊髓横断损伤模型，初步探讨自噬抑制剂和自噬促进剂在SCI后对自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达变化的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠(广东药科大学实验动物中心提供)84只，体重(230±18)g，随机分成对照组(0 h)和实验组(SCI组)，实验组依照SCI后的时间依次划分为损伤后4、12 h及1、3、5、7 d组，每组12只。整个实验过程中室温饲养，大鼠自由进食和饮水。

1.2 实验动物模型的制备 参照文献制备大鼠SCI模型〔3〕，采用复合麻醉方法：复合麻醉剂(即水合氯醛 4.25 g，硫酸镁2.12 g，戊巴比妥钠 886 mg，无水乙醇 33.8 ml，双蒸水定容至100 ml)3 ml/kg ，以T8棘突为中心，切取背部正中切口，暴露 T6～T10棘突及椎板，通过使用手术钳除去 T8～T10棘突及全椎板，以脊髓为中心对直径约 5 mm的圆形区进行暴露，采用10 g冲击棒，使圆形薄铜垫片(直径 3.5 mm)击于脊髓背侧，打击致 T8脊髓急性挫伤。对照组仅行椎板和棘突切除，不损伤脊髓，无行为学及后肢运动障碍。

1.3 行为学功能测试 所有大鼠通过BBB(Basso，Beattie，Bresnahan)进行评分，自由活动4 min后通过观察记录不同组别大鼠后肢的运动情况。评分采用双盲法，第一部分为0～7分，主要对恢复早期的后肢关节运动状况进行评估；第二部分为8～13分，主要对恢复中期的步态及其协调运动进行评估；第三部分为14～21分，主要对大鼠运动时爪子的精细运动进行评估，最后取其平均值为BBB评分值。

1.4 Western印迹检测自噬相关蛋白LC3和Beclin1的表达 分别取对照组及SCI后4 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d的大鼠6只称重。采用颈部处死的方式，快速暴露损伤部位的脊髓，在无菌条件下取出小块损伤的脊髓并置于液氮中保存。随后以100 g/L加入蛋白裂解液，冰浴匀浆。13 000 r min 4℃离心15 min，取上清，采用紫外分光光度计测定蛋白含量。

分别取对照组和SCI组蛋白样品各40 μg，加入4×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液(含10%β-巯基乙醇)，沸水中煮沸5 min，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，随后进行电转移。转移后的聚偏氟乙稀(PVDF)膜用含10%脱脂奶粉的Tris盐酸缓冲液(TBST)缓冲液室温包被2 h，然后用抗PISTLRE抗体(1∶200)室温孵育1 h后4℃过夜，TBST漂洗，转入辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗免IgG(1∶2 000)中，室温孵育2 h，TBST漂洗5次，增强化学发光法(ECL)发光，显影，定影。最后通过图像分析仪进行比较分析。每组重复3次，取OD值的平均值进行统计学分析。

1.5 Western印迹检测Rapamycin和3-MA作用SCI大鼠后自噬相关蛋白LC3和Beclin1的表达 以2.5 mg/kg浓度的3-MA和0.5 mg/kg浓度的Rapamycin分别作用于SCI大鼠，对0、4、12 h、1、3、5、7 d 7个时间点的组织样分别提取蛋白，Western印迹进行自噬相关蛋白LC3和Beclin1的检测。方法同1.4。

1.6 统计学方法 应用SPSS22.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 行为学评分 对照组大鼠活动正常，步态协调，足趾能够持续抓地，尾巴持续翘起，动物躯体能够维持稳定，BBB评分为23分。SCI 3 d后，大鼠无运动现象，后侧肢体瘫痪，BBB评分为0.9分；随着大鼠SCI后时间的不断延长，其所配的运动功能出现恢复迹象。见图1。

2.2 自噬相关蛋白LC3和Beclin1的检测 SCI后，自噬相关蛋白LC3和Beclin1 的表达量与对照组相比出现升高的趋势，随着损伤时间的不断延长，其表达量也呈现升高的趋势。SCI后3 d表达量显著升高(P<0.01)；之后，其表达量随SCI时间的延长呈现下降的趋势。见图2。

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01 图1 大鼠SCI后的BBS评分

图2 Rapamycin和3-MA对自噬相关蛋白L3的检测

2.3 自噬促进剂Rapamycin和自噬抑制剂3-MA对Beclin 1和LC3的影响 见图3。Rapamycin作用于SCI大鼠后，随着损伤时间的延长Beclin1、LC3的表达量呈现上升的趋势，SCI 3 d后Rapamycin组Beclin1、LC3的表达量与对照组相比显著增高，达到极显著水平(P<0.001)；3-MA组Beclin 1、LC3的表达量与对照组相比显著降低(P<0.01)。随后，随着SCI时间的延长，其表达水平呈现下降趋势。

图3 Rapamycin和3-MA对自噬相关蛋白Beclin1的检测

3 讨 论

自噬是生命机体内重要的代谢方式，在动物、植物和单细胞生物中广泛存在，在细胞增殖分化、组织发育和稳态的维持中发挥重要作用〔4〕。自噬主要通过以下途径发挥作用：(1)参与细胞生长、分化，组织发育和重塑基本生命过程；(2)在营养不足时，细胞可以通过自噬作用将自身的大分子营养物质分解后再吸收以保证自身能量代谢的需要；(3)当机体受到病原体感染后，自噬与免疫系统的激活与调控有关；(4)自噬可以清除细胞内的损伤蛋白，降解异常寿命的蛋白从而起到保护细胞的作用。但当自噬过度或不足时，细胞内的异常蛋白被聚集后阻碍细胞的正常生命活动，引发多种慢性疾病〔5〕。自噬参与多种疾病的调控，如SCI、恶性肿瘤、自身免疫疾病等〔6～8〕。

目前报道的SCI机制主要包括炎症反应学说、血管学说、内环境失衡学说和凋亡坏死学说。SCI后的再生是其功能修复的主要表现。自噬在SCI后的作用研究在国内外尚处于起步阶段。研究结果显示SCI后自噬细胞的死亡与Beclin1表达异常升高有关〔9〕。Beclin1作为一种自噬相关蛋白，能够促进自噬的发生，且在SCI后Beclin1的表达量显著增高〔10〕。Beclin1在神经元和胶质细胞中呈现高表达，这在一定程度上促进了自噬现象的激活。LC3作为自噬发生的相关蛋白，同样在神经元和胶质细胞中表达量升高，并参与自噬体双层膜的形成〔11〕。研究表明，在SCI模型体注射Rapamycin能够增强自噬相关蛋白的表达〔12〕，而神经元的损伤和胶质细胞的死亡率明显下降。表明Rapamycin能够促进自噬现象的发生。3-MA作为自噬抑制剂在自噬小体的形成和发展过程中起到阻遏作用，对细胞内蛋白质平衡也有一定影响，并进一步加重了疾病的发展〔13〕。本研究结果表明，Rapamycin可以有效促进SCI后的细胞自噬，3-MA具有阻碍SCI后细胞自噬的作用。但Rapamycin和3-MA在SCI后自噬现象发生的作用机制还不明确，有待进一步研究。

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13 Pedro JM，Wei Y，Sica V，etal.BAX and BAK1 are dispensable for ABT-737-induced dissociation of the BCL2-BECN1 complex and autophagy〔J〕.Autophagy，2015；11(3)：452-9.

〔2016-10-12修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

广东省自然科学基金项目(2014A030313360)

黄旭明(1963-)，男，主任医师，主要从事神经康复研究。

张 滨(1982-)，男，主治医师，主要从事神经康复研究。

R493

A

1005-9202(2017)05-1071-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.014