辛伐他汀对膝骨关节炎大鼠MMP-3、MMP-9、TGF-β1表达的影响及作用机制

孙乃坤 王耀宗 刘志刚 付代杰 尚希福 李 旭

(厦门大学附属第一医院骨科，福建 厦门 361003)

辛伐他汀对膝骨关节炎大鼠MMP-3、MMP-9、TGF-β1表达的影响及作用机制

孙乃坤 王耀宗1刘志刚2付代杰3尚希福3李 旭3

(厦门大学附属第一医院骨科，福建 厦门 361003)

目的 探讨辛伐他汀对膝骨关节炎大鼠基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-9、转化生长因子(TGF)-β1表达水平的影响及其作用机制。方法 40只胶原诱导膝骨关节炎造模成功的大鼠随机分为模型组和低剂量组、中剂量组和高剂量组，另选取10只未造模大鼠作为对照组。分别给予低、中、高剂量组0.01、0.1、0.5 mg/ml辛伐他汀稀释液灌胃，剂量为0.2 ml/kg，同时给予对照组和模型组同等剂量无菌生理盐水灌胃。6 w后处死，采用免疫组化法检测组织中Caspase-3表达情况。对比5组给药前、3 w和6 w后血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1水平变化及Caspase-3表达情况。结果 用药前对照组血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1表达水平均较其他各组显著降低(P<0.05)，3 w后和6 w后对照组和模型组血清因子水平均无显著变化(P>0.05)，而低、中、高剂量组均随着用药时间延长而显著降低(P<0.05)，3 w和6 w后各项指标水平按照由高到低排列为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和对照组，且每两组间差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组Caspase-3 OD值远远高于中剂量组和低剂量组(P<0.05)，中剂量组远远高于低剂量组(P<0.05)，低剂量组较对照组和模型组高(P<0.05)，对照组和模型组无显著差异(P>0.05)。结论 辛伐他汀可改善膝骨关节炎大鼠血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1水平，在一定范围内剂量越高作用效果越好，推测可能和Caspase-3异常激活有关。

辛伐他汀；膝骨关节炎；基质金属蛋白酶；转化生长因子β1

膝骨关节炎是老年人群中常见疾病类型，以活动障碍和关节疼痛为主要临床表现，严重影响居民生活质量。对于晚期膝骨关节炎，临床上常采用关节置换外科手术方式解除痛苦，但是大部分早期和中期患者常采用保守治疗，而效果不甚理想〔1〕。非甾体类抗炎药是当前针对膝骨关节炎的常用药物，尽管能够在一定程度上减轻痛苦，但是在关节软骨结构和功能方面保护作用并不理想，且无法延缓病情进展，长期使用还易造成胃肠系统严重副作用。辛伐他汀是常用降脂药物，但是近年来研究发现该药物可以抑制炎症反应，同时还可抑制基质金属蛋白酶(MMP)，推测对膝骨关节炎软骨结构和功能也有一定改善作用〔2〕。基于此，本研究通过观察辛伐他汀对膝骨关节炎模型大鼠相关因子表达水平的影响及其作用机制。

1 资料与方法

1.1 动物 选取50只健康雄性大鼠，体质量130～160 g，平均(142.56±5.13)g，均由实验动物中心提供。喂养条件：适应性喂养7 d，光照和黑暗交替12 h，温度保持(22±2)℃，分笼喂养，可自由活动。

1.2 建模和分组 选取40只大鼠首先给予戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉；采用Hulth法对后肢踝关节利用胶原诱导膝骨关节炎。造模成功后采用随机数字表法将其分为模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组各有10只大鼠。将剩余10只未造模大鼠记为对照组。

1.3 给药方法 将一定剂量辛伐他汀溶于无菌生理盐水中，制作浓度为0.01、0.1、0.5 mg/ml的稀释液，分别给予低、中、高剂量组大鼠0.2 ml/kg稀释液灌胃。模型组和对照组均在相同时间段给予同等剂量的无菌生理盐水灌胃，5组大鼠均连续给药(或生理盐水)6 w。

1.4 血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1检测方法 所有大鼠均分别于给药前、3 w后和6 w后抽取3 ml静脉血，离心后利用全自动生化分析仪对上清液待检样品进行检测，均为酶联免疫法，所用试剂盒均由上海哈灵生物科技有限公司提供。

1.5 Caspase-3表达检测方法 所有大鼠均于6 w后处死，取后肢踝关节病变组织置于甲醛溶液(浓度为10%)中固定，参照《现代实验动物学技术》〔3〕相关操作行免疫组化法染色并观察Caspase-3表达情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS19.0统计学软件，计量资料多样本比较用F检验，两两比较用SNK-q检验。

2 结 果

2.1 血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1表达水平 表1～表3可见，用药前对照组血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1均较低、中、高剂量组和模型组显著降低(P<0.05)，3 w后和6 w后对照组和模型组血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1水平均无统计学意义(P>0.05)，而低、中、高剂量组均随着用药时间延长而显著降低(P<0.05)，3 w后和6 w后血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1水平按照由高到低排列为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和对照组，且每两组间差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 血清MMP-3表达水平比较

与用药前比较：1)P<0.05；与3 w后比较:2)P<0.05；与对照组比较:3)P<0.05；与低剂量组比较:4)P<0.05；与中剂量组比较:5)P<0.05；与高剂量组比较:6)P<0.05；下表同

表2 血清MMP-9表达水平比较

表3 血清TGF-β1表达水平比较

2.2 Caspase-3表达情况 高剂量组Caspase-3 OD值(20.92±1.71)远远高于中剂量组(15.78±1.67)和低剂量组(12.34±1.35)(P<0.05)，中剂量组远远高于低剂量组(P<0.05)，低剂量组也较对照组(10.25±1.23)和模型组(10.27±1.19)(P<0.05)，而对照组和模型组无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

膝骨关节炎发病机制相关研究较多，可归结为软骨合成降解因子水平异常降低、促合成因子水平明显增高，而在此种病理改变过程中，炎症因子水平紊乱逐渐引起并加重炎症反应是该病发展的重要推动因素〔4，5〕。目前研究较多的主要有MMP-3、MMP-9和TGF-β1等〔6〕。MMP-3在许多正常生理过程中均有参与，如形态生成、组织愈合、损伤修复等，但是一旦相关基因过度表达造成MMP-3水平异常升高将会导致其细胞外基质蛋白质降解等生物学功能被异常激活，使得成纤维细胞、血管平滑肌细胞、软骨细胞和内皮细胞等均在短时间内大量生成，在膝骨关节炎、心血管疾病和癌症等病变过程中起到重要促进作用；MMP-9在肿瘤坏死因子、 血小板源生长因子等诱导下均可明显增高，增强细胞外基质蛋白质降解功能，导致正常组织结构和功能被严重破坏，最终促进膝骨关节炎形成和发展；TGF-β1属于转化生长因子，具有多种生物学作用：①促进细胞外基质蛋白质降解；②促进成骨细胞和成纤维细胞生长；③抑制破骨细胞和上皮细胞生长和生物学功能；④趋化单核细胞和成纤维细胞〔7,8〕。上述各种生物学作用均可通过不同途径导致膝骨关节炎的形成和进展。

随着关于膝骨关节炎形成和发展中基因表达异常认知逐渐深入，Caspase-3对血清MMP-3、MMP-9和TGF-β1因子表达水平的调控作用也成为研究的重点和热点〔9,10〕。Caspase-3主要作用在于执行细胞凋亡〔11〕。一旦基因突变导致DNA复制、转录以及损伤修复作用异常，将会使得对Bcl-2拮抗作用减弱，而成纤维细胞和软骨细胞水平将会异常升高，使相关因子水平调控作用减弱，最终引发膝骨关节炎。辛伐他汀属于一种重要的还原酶抑制剂，可以通过抑制Rho通路对过氧化物酶体增殖物产生促进作用，激活Caspase-3表达，使得其阳性表达水平被明显调高，进而使得T淋巴细胞成熟加快，对机体产生显著免疫调节和抗炎作用，最终通过不同途径和作用机制将膝骨关节炎血清MMP-3、MMP-9、TGF-β1因子水平下调，促进病情迅速恢复〔12〕。据国外相关动物模型实验研究表明，MMP-3、MMP-9、TGF-β1异常高水平表达既是膝骨关节炎患者外在表现，同时又是病情加重的重要促进因素〔13〕。采用辛伐他汀可以激活Caspase-3表达，同时下调上述血清因子水平，推测其间存在一定相关性和调节作用。

综上，在一定范围内，高剂量辛伐他汀对膝骨关节炎实验大鼠病情改善作用显著，推测可通过激活Caspase-3表达下调血清MMP-3、MMP-9、TGF-β1表达水平，改善症状和严重程度，为此类患者临床治疗提供一种全新的思路和参考方案。

1 宰庆书,蒋长伟,岳耀升,等.鲁西南邹城市膝骨性关节炎的流行病学调查及早期阶梯性治疗〔J〕.中国组织工程研究,2015;19(29):4609-13.

2 马文俊.A型肉毒毒素对膝骨性关节炎大鼠模型镇痛效果及机制的实验研究〔D〕.太原：山西医科大学,2015.

3 吴端生.现代实验动物学技术〔M〕.北京：化学工业出版社,2007:295-312.

4 吴广文,叶锦霞,许惠凤,等.透骨消痛胶囊对KOA大鼠关节软骨uPA系统相关调节因子的影响〔J〕.世界中西医结合杂志,2015;10(1):22-6,55.

5 任莎莎,李雪萍,林 强,等.低强度脉冲超声经 PI3K/Akt 通路调控兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡的作用机制研究〔J〕.中国康复,2015;30(2):83-7.

6 梁楚西,郭 妍,陶 琳,等.针刀对膝骨性关节炎兔软骨细胞外基质Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖相关蛋白表达的影响〔J〕.针刺研究,2015;40(2):119-24,140.

7 赵甲军,黄遂柱.兔膝关节骨性关节炎半月板形态改变及基质金属蛋白酶-3和金属蛋白酶组织抑制剂-1表达〔J〕.中华实用诊断与治疗杂志,2015;29(6):546-8.

8 陈 明,王丹娜,高福明,等.关节液TNF-α和TGF-β1检测在膝骨性关节炎中的应用〔J〕.中国现代医生,2015；53(19):22-5.

9 梁建红.膝骨性关节炎患者血清白细胞介素-1、6和转化生长因子-β1水平的变化及意义〔J〕.中国基层医药,2014;21(16):2428-9.

10 徐守宇,姚新苗,翟 云,等.膝关节骨关节炎发病过程中HSP70对软骨细胞凋亡的影响〔J〕.中国骨伤,2012;25(10):846-51.

11 孟庆才,方 锐,吕 刚.维药买朱尼对骨性关节炎Caspase-3的调节作用〔J〕.中国民族医药杂志,2007;13(12):62-4.

12 于春伟,丛大忞,杨春晓.辛伐他汀对脑缺血-再灌注损伤大鼠周围血MIP-3α、BDNF、cleaved Caspase-3表达与mNSS 的影响〔J〕.脑与神经疾病杂志,2015;23(5):358-62.

13 Ahsin S,Saleem S,Bhatti AM,etal.Clinical and endocrinological changes after electro-acupuncture treatment in patients with osteoarthritis of the knee〔J〕.Pain,2009;147:60-6.

〔2016-09-20修回〕

(编辑 徐 杰)

Effect of simvastatin on expression levels of MMP-3,MMP-9 and TGF-β1 of rats with osteoarthritis of the knee

SUN Nai-Kun, WANG Yao-Zong, LIU Zhi-Gang,etal.

The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361003, Fujian, China

Objective To discuss the effect of simvastatin on expression levels of matrix metalloproteinase (MMP) -3, MMP-9 and transforming growth factor (TGF) -β1 of rats with osteoarthritis of the knee,and to explore the mechanism of action.Methods 40 successful modeling rats with osteoarthritis of the knee induced by collagen were randomly divided into model,low dose,middle dose and high dose groups,and another 10 rats without modeling were selected as the control group.The low,middle and high dose groups were respectively given 0.01,0.1,0.5mg/ml of simvastatin diluted solution,with the dose of 0.2 ml/kg,then the control and model groups were given same dose of sterile saline to fill the stomach at the same time.6 weeks later, the expression of Caspase-3 was detected by immunohistochemistry.The changes of serum levels of MMP-3, MMP-9, and TGF-β1 before medication,after 3 and 6 weeks were compared among the 5 groups,as well as the expressions of Caspase-3,then the mechanism of action of simvastatin on rats with osteoarthritis of the knee was analyzed.Results The expression levels of serum MMP-3, MMP-9, and TGF-β1 in the control group before medication were significantly lower than that in the other groups (P<0.05),and the levels in the low,middle and high dose groups were significantly decreased with the increase of medication time (P<0.05),then the levels after 3 weeks and 6 weeks were ranked from high to low as follows:the model group,low dose group,middle dose group ,high dose group and control group (P<0.05).The OD value of Caspase-3 in the high dose group was far higher than that in the middle and low dose groups (P<0.05),while the value in the middle dose group was far higher than that in the low dose group (P<0.05),as well as the value in the low dose group was far higher than that in the control group and model group (P<0.05),but there was no significant difference between the control group and model group (P>0.05).Conclusions Simvastatin can improve the serum levels of MMP-3, MMP-9, and TGF-β1 in rats with osteoarthritis of the knee,and in a certain range the higher the dose,the better the effect,and it can be speculated that it may be related to the abnormal activation of Caspase-3.

Simvastatin;Osteoarthritis of the knee;Matrix metalloproteinases; Transforming growth factor β1

国家自然科学基金(81201383)；安徽省教育厅自然科学基金(KJ2001Z204)

孙乃坤(1981-)，男，硕士，主治医师，主要从事骨科方面研究。

R684.3

A

1005-9202(2017)05-1050-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.004

1 厦门大学附属中山医院骨科 2 吉林大学第二医院骨科

3 安徽医科大学附属省立医院骨二科