福辛普利对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的影响

谢亚芹 赵 娟 李秀华 冯翔宇

(承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000)

福辛普利对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的影响

谢亚芹 赵 娟 李秀华1冯翔宇1

(承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000)

目的 探讨福辛普利对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3 表达水平的影响。方法 雄性Wistar大鼠50只随机抽取10只为假手术组，其余大鼠采用肾上腹主动脉缩窄法建立大鼠CHF模型，6 w后将成模大鼠随机分为CHF组、Fos10组、FOS20组(福辛普利10、20 mg·kg-1·d-1)。治疗8 w后，观察各组大鼠血流动力学指标和左心室重量指数(LVMI)；透射电镜观察左室心肌组织形态的改变；TUNEL法检测大鼠左心室心肌细胞的凋亡指数；SP免疫组织化学染色法检测左心室心肌组织Caspase-3蛋白的表达。结果 CHF组与假手术组相比，大鼠左心室舒张末压(LVEDP)、LVMI、心肌细胞凋亡指数、Caspase-3蛋白的表达均明显升高(P<0.01)，左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)显著下降(P<0.01)；与CHF组比较，Fos10组和Fos20组大鼠LVEDP、LVMI、心肌细胞凋亡指数、Caspase-3蛋白的表达均明显降低(P<0.01)，左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)显著升高(P<0.01)，且Fos20组效果明显。电镜下观察：Fos10组和Fos20组心肌损伤程度较CHF组明显减轻。结论 福辛普利可通过下调Caspase-3的表达抑制心肌细胞凋亡，改善CHF大鼠心室功能及心肌超微结构。

福辛普利；慢性心力衰竭；超微结构；细胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

慢性心力衰竭(CHF)发生时左室功能的不断恶化是心肌细胞凋亡或(和)剩余的心肌细胞收缩功能代偿不足的结果，而凋亡可能是心肌细胞不断丢失的根源所在〔1～3〕。作为第三代血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)类药物的福辛普利在逆转心肌肥厚，降低心脏负荷的同时具有作用时间更长，副作用减少，肝肾双重排泄等优点，因此成为近年来研究的热点。但其能否抑制CHF心肌细胞凋亡及作用是否存在剂量依赖性仍需进一步研究。本研究将以腹主动脉缩窄方式建立慢性压力负荷性心力衰竭动物模型，观察福辛普利对CHF大鼠心肌细胞的超微结构、心肌细胞凋亡及凋亡相关调节基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性Wistar大鼠50只(北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证编号：2009-0004)，福辛普利(10 mg，商品名：蒙诺，购自中美上海施贵宝制药有限公司)，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(美国罗氏Roche公司)，Caspase-3兔抗多克隆抗体(武汉博士德生物公司)，SP免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备及分组 将50只大鼠适应性喂养1 w后，随机抽取10只作为假手术组，其余大鼠全部采用肾上腹主动脉缩窄手术制作CHF模型〔4〕。假手术组只分离腹主动脉而不结扎。术后均给予青霉素20万U连续3 d腹腔注射，常规喂养6 w，造模大鼠逐渐出现呼吸、心跳加快、倦怠无力、食欲减退等表现，模型制备中死亡10只，假手术组大鼠无死亡。检测血流动力学参数，以左心室舒张末压(LVEDP)≥15 mmHg作为成模标准，待成功建立模型后，将成模大鼠随机分为3组，即CHF组、Fos10组和Fos20组，每组10只。Fos10组和Fos20组大鼠分别给予福辛普利10 mg·kg-1·d-1和20 mg·kg-1·d-1，CHF组和假手术组大鼠给予生理盐水灌胃，连续8 w。

1.2.2 血流动力学监测 将大鼠测体重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 g/kg)大鼠，经右颈总动脉逆行插管至左心室，另一端接压力换能器输入多媒体生物信号记录仪系统，获取LVEDP，左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。

1.2.3 标本制备及计算左心室重量指数(LVMI) 福辛普利治疗结束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 g/kg)，进行血流动力学监测后，迅速开胸取出心脏，冰生理盐水洗净，分离左心室称重，后将部分放入4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡和包埋，备用于TUNEL法检测细胞凋亡、免疫组织化学染色检测Caspase-3蛋白表达。另取1 mm3大小的左心室组织数块放入3.1%戊二醛中固定，留待电镜检测心肌组织的超微结构改变。LVMI=大鼠左心室重量/大鼠体重。

1.2.4 心肌组织超微结构的观察 取1 mm3大小的左心室心肌数块放入3.1%戊二醛溶液内，经0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗后再固定于10 %锇酸溶液中，按电镜常规技术脱水、包埋，用EMUC6 型超薄切片机(德国莱卡公司)作超薄切片，经醋酸钠与枸橼酸铅双重染色，在H-7650B透射电镜(日本日立公司)下观察并照相。

1.2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 石蜡切片常规脱蜡至水，proteinase K工作液消化15 min，TUNEL反应液37℃孵育60 min，过氧化物酶转化剂37℃孵育30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。凋亡细胞的细胞核呈棕褐色着染。凋亡指数(AI)的确定：以TUNEL阳性细胞数目与同一视野神经细胞总数的比值作为左心室心肌细胞凋亡指数，每只动物任选3张切片，每张切片选取4个视野，取平均值。

1.2.6 免疫组织化学检测Caspase-3蛋白的表达 采用SP法检测左心室心肌组织Caspase-3蛋白的表达。Ⅰ抗分别为Caspase-3多克隆抗体，稀释浓度均为1∶100。实验同时以0.01 mmol/L PBS代替第1抗体作为阴性对照，以胞质中出现棕黄色颗粒为阳性反应，采用MiVnt图像分析系统在10×20倍显微镜下对免疫阳性结果进行半定量分析，以免疫阳性产物面积与视野面积的比值表示该抗原的相对含量。每只动物任选3张切片，每张切片选取4个视野，取平均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1 血流动力学参数及LVMI检测结果 与假手术组相比，CHF组大鼠LVEDP、LVMI显著增高(P<0.01)，±dp/dtmax明显下降(P<0.01)；与CHF组相比，Fos10组和Fos20组大鼠LVEDP、LVMI明显下降(P<0.01)，±dp/dtmax明显上升(P<0.01)，Fos20组效果明显(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠血流动力学参数、LVMI、AI及心肌组织Caspase-3表达比较

与CHF组比较：1)P<0.01;与Fos10组：2)P<0.01

2.2 心肌细胞超微结构的观察 电镜下观察：假手术组心肌细胞轮廓清晰，粗细肌丝排列整齐，明暗带清晰可见，细胞核呈椭圆形，核仁居中。CHF组心肌细胞出现心肌凋亡征象，表现为肌丝排列紊乱，肌节错位、各带结构分辨不清，部分灶性溶解，线粒体肿胀、嵴不同程度断裂溶解，心肌细胞水肿，细胞核固缩，染色质边集。Fos10组和Fos20组心肌细胞损伤明显减轻，细胞轻度水肿，肌纤维排列规则，心肌线粒体形态结构改变较CHF组明显减轻。Fos20组心肌细胞超微结构改善优于Fos10组。见图1。

2.3 心肌细胞凋亡检测结果 见表1、图2。TUNEL阳性产物位于胞核，呈棕褐色颗粒状。与假手术组比较，CHF组大鼠心肌组织细胞凋亡明显增多，AI明显增高(P<0.01)；Fos10组和Fos20组大鼠心肌组织细胞AI较CHF组明显降低(P<0.01)，Fos20组降低更为显著(P<0.01)。

图1 各组大鼠左心室心肌组织的超微结构(×20 000)

图2 TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡(TUNEL法，×400)

2.4 免疫组织化学法检测心肌组织Caspase-3蛋白表达结果 Caspase-3免疫阳性产物呈棕黄色，位于心肌细胞质。CHF组较假手术组大鼠心肌组织Caspase-3蛋白表达增高(P<0.01)，Fos10组和Fos20组较CHF组Caspase-3蛋白表达降低，Fos20组降低更加显著(P<0.01)。见表1、图3。

图3 各组大鼠左心室心肌组织Caspase-3蛋白表达(DAB，×400)

3 讨 论

研究证实，机械牵张可以诱导心肌细胞的凋亡〔5〕。因此采用缩窄肾上腹主动脉所致压力负荷增加可诱导心肌细胞凋亡和间质纤维化〔6〕。本研究表明CHF组大鼠明显出现心功能的恶化，同时LVMI增加，提示CHF组大鼠心室壁增厚，出现心肌肥厚，在慢性压力负荷增加时，可发生心肌细胞的凋亡及心肌纤维化，并最终导致心功能的恶化。福辛普利作为一种ACEI，能够有效抑制周围血管及组织紧张素转化酶的作用，减少血管紧张素Ⅱ的刺激作用，减轻氧化应激，提高缓激肽的水平，从而发挥抗凋亡作用〔7,8〕。本研究显示福辛普利可改善心室功能，有效抑制了心肌重构及心肌细胞凋亡的发生。在超微结构上，福辛普利可通过对保护线粒体及心肌纤维的正常结构，减少胶原纤维的生成而改善心肌的超微结构，并且高剂量组效果更加显著。

与坏死不同，细胞凋亡是受基因控制的程序化的死亡过程。线粒体在缺血、缺氧、 氧化应激、细胞钙超载等病理条件下，会发生肿胀释放细胞色素C，激活Caspase-3〔9〕。Caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的关键蛋白酶，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，其活化标志着凋亡进入不可逆阶段〔10〕。现已证实Caspase-3在心、脑等重要器官缺血再灌注过程及肿瘤细胞均异常表达〔11,12〕，参与细胞凋亡。本研究中通过福辛普利的治疗可抑制心肌凋亡基因Caspase-3的表达，提示对Caspase-3表达的抑制作用可能是该药抗心肌凋亡的分子机制之一，福辛普利下调Caspase-3的表达可呈剂量依赖性。但关于福辛普利钠长期应用的合理剂量及对重要脏器的毒副作用等问题还有待进一步研究。

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2 Elnakish MT，Hassona MD，Alhaj MA，etal.Rac-induced left ventricular dilation in thyroxin-treated ZmRacD transgenic mice: role of cardiomyocyte apoptosis and myocardial fibrosis〔J〕.PLoS One，2012;7(8):e42500.

3 Song YH，Cai H，Gu N，etal.Icariin attenuates cardiac remodeling through down-regulating myocardial apoptosis and matrix metalloproteinase activity in rats with congestive heart failure〔J〕.J Pharm Pharmacol，2011;63(4):541-9.

4 谢亚芹，康大伟，李秀华.慢性心力衰竭心肌纤维化大鼠模型的建立〔J〕.承德医学院学报，2011;28(1):10-2.

5 Liao XD，Liu JM，Du L，etal.Nitric oxide signaling in stretch-induced apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes〔J〕.FASEB J，2006;20(11): 1883-5.

6 付德明，吕元吉，廉玉明，等.氯沙坦增加Akt活性对慢性心力衰竭大鼠心功能及心肌细胞凋亡的保护作用〔J〕.中华老年心脑血管病杂志，2009;11(11): 867-71.

7 Veqter S，Nquyen NH，Visser ST，etal.Compliance，persistence，and switching patterns for ACE inhibitors and ARBs 〔J〕.Am J Manaq Care，2011;17(9): 609-16.

8 Garcia-Faroldi G，Melo FR，Ronnberg E，etal.Active caspase-3 is stored within secretory compartments of viable mast cells〔J〕.J Immunol，2013;191(3):1445-52.

9 Tereshchenko SN，Zhirov IV.Fosinopril in the treatment of cardiorenal syndrome in chronic cardiac failure〔J〕.Ter Arkh，2009;81(5):84-8.

10 吴云飞，郑维银，李 焰.Caspase-3 在血管内皮细胞凋亡中的作用研究进展〔J〕.西南军医，2013;15(4):408-11.

11 Li SX，Chai L，Cai ZG，etal.Expression of survivin and caspase 3 in oral squamous cell carcinoma and peritumoral tissue 〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2012;13(10):5027-31.

12 Xue G，Zou X，Zhou JY，etal.Raddeanin A induces human gastric cancer cells apoptosis and inhibits their invasion in vitro 〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2013;439(2):196-202.

〔2015-11-27修回〕

(编辑 曹梦园)

河北省卫生厅医学研究重点课题计划项目(20110180)；河北省高校重点学科建设项目资助(冀教高〔2013〕4号病理学与病理生理学)

谢亚芹(1983-)，女，硕士，讲师，主要从事心力衰竭的基础与临床研究。

R541.6

A

1005-9202(2017)05-1056-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.007

1 承德医学院附属医院老年病科