A型肉毒毒素对P物质引发的离体食管下括约肌收缩的抑制作用

周媛媛 李超彦 王福青 楚宪襄

(漯河医学高等专科学校基础医学部，河南 漯河 462002)

A型肉毒毒素对P物质引发的离体食管下括约肌收缩的抑制作用

周媛媛 李超彦 王福青 楚宪襄1

(漯河医学高等专科学校基础医学部，河南 漯河 462002)

目的 观察A型肉毒毒素(BTX-A)对电场刺激(EFS)、内源性及外源性P物质(SP)引发的SD大鼠离体食管下括约肌(LES)收缩的影响。方法 SD大鼠叩击头部致昏后剪取食管下段与贲门交界处组织制备肌条。使用EFS诱发肌条内源性递质释放，阿托品阻断胆碱受体作用后，观察NK1受体拮抗剂(APTL-SP)、BTX-A对LES收缩的影响；观察不同浓度APTL-SP、BTX-A，对外源性SP引发的LES收缩变化影响。采用Biolap BL-420E生物机能实验系统同步记录肌条的收缩变化曲线。结果 EFS可增强LES的收缩张力及振幅(P<0.01)，BTX-A、阿托品、APTL-SP均可单独抑制其效应(P<0.05或P<0.01)，而阿托品作用后BTX-A可进一步降低LES的收缩张力及振幅(P<0.05)；EFS的增强LES收缩效应，在被阿托品抑制后，可被后加入的APTL-SP进一步抑制(P<0.05)；阿托品与APTL-SP对EFS引发的LES收缩的协同抑制效应和BTX-A的抑制效应对比，二者无统计学差异(P>0.05)。外源性加入的SP可显著增强LES收缩张力(P<0.01)及振幅(P<0.05)。结论 BTX-A可抑制EFS诱发的内源性SP引发的LES缩增强，其对外源性SP引发的LES收缩也具有抑制效应。

A型肉毒毒素；P物质；食管下括约肌；电场刺激

A型肉毒毒素(BTX-A)是革兰阳性厌氧肉毒杆菌在繁殖过程中产生的外毒素， 可裂解神经-骨骼肌突触前膜内的突触囊泡膜上的SNAP-25蛋白，导致含乙酰胆碱(ACh)的囊泡出胞障碍，阻碍了ACh的释放而导致骨骼肌松弛、麻痹〔1～3〕。目前针对BTX-A对平滑肌收缩作用机制研究较少，近年研究发现，BTX-A对SD大鼠胃体、胃底及食管下括约肌(LES)等离体平滑肌的自发性收缩及P物质(SP)引发的收缩存在抑制作用〔4,5〕。本研究拟观察BTX-A对电场刺激(EFS)诱发的内源性和外源性加入的SP所致的LES收缩的影响，结合NK1受体拮抗剂(APTL-SP)、阿托品药理效应，进一步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠55只，体重280～320 g，雌雄不拘，由郑州大学医学院实验动物中心提供(合格证号医动字第20120133号)。

1.2 药品与试剂 阿托品、SP、APTL-SP均购自Sigma公司；冻干BTX-A(100 U/安瓿，-20℃闭光保存)兰州生物制品研究所。其余试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器 HW-400S恒温平滑肌槽(四川成都泰盟科技有限公司)，联想微型兼容计算机内置Biolap 420E生物机能实验系统(四川成都泰盟科技有限公司)，JH-2型张力传感器(北京航天医学工程研究所)，银片电极(自制)。

1.4 标本制备 实验前大鼠禁食18～24 h，饮水不限；实验时叩击其头部致昏，迅速剖腹剪取食管下段与胃贲门交界处组织；沿长轴切开平滑肌后，采用自制切割器剪取制备长8 mm、宽2 mm的LES肌条，每只大鼠组织可制备2～3条。将肌条温育于预充满37℃Kreb液的恒温平滑肌槽中孵育，肌条一端固定在肌槽底部的玻璃弯钩上，另一端固定在张力传感器上，肌条长轴与电极长轴平行，肌槽内持续供给含95%O2和5%CO2混合气体。肌条温育30 min后，以出现自发性收缩为标准选作为实验标本。

1.5 分组与给药 LES肌条随机分为10组，每组10条：①EFS组，在自发性收缩的条件下记录30 min，附加EFS；②EFS+阿托品组，附加EFS，后加入阿托品(1 μmol/L)；③EFS+BTX-A组，附加EFS，后加入BTX-A(10 U/ml)；④EFS+APTL-SP组，附加EFS，加入APTL-SP(1 μmol/L)；⑤EFS+阿托品+APTL-SP组；⑥EFS+阿托品+BTX-A组，附加EFS，后加入阿托品(1 μmol/L)，再加入APTL-SP(1 μmol/L)或BTX-A(10 U/ml)；⑦EFS+BTX-A+APTL-SP组，附加EFS，后加入BTX-A(10 U/ml)，再加入APTL-SP(1 μmol/L)；⑧SP组，在自发性收缩的条件下记录30 min，后加入SP(1 μmol/L)；⑨SP+APTL-SP组，加入SP (1 μmol/L)，后加入APTL-SP(1 μmol/L)；⑩SP+BTX-A组，加入SP (1 μmol/L)，后加入BTX-A(10 U/ml)。各实验组中附加EFS的参数(频率4 Hz、电压100 V、0.5波宽、60 s持续刺激〔2〕)设置均相同，且在附加EFS之前均预先加入NO酯酶抑制剂(L-NAME)抑制NO介导的肌肉松弛作用。每次附加EFS或加入各种药物后均需持续记录LES收缩波形30 min，LES肌条预孵育TSN(29.6 μmol/L)的时间均为30 min。在①和⑧分别以EFS或加药前LES平滑肌的自发性收缩波形作为对照。各组平滑肌条收缩变化经张力传感器转换，由Biolap 420-E生物机能实验系统同步记录收缩张力及振幅等实验数据。

1.6 统计学方法 采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 BTX-A抑制内源性SP引发的LES的收缩 与对照组比较，附加EFS刺激后，在EFS组可见LES收缩张力及振幅均显著增大(P<0.01)；附加EFS后引发的平滑肌收缩增强，在加入BTX-A或阿托品或APTL-SP均可被抑制(P<0.05或P<0.01)，持续记录30 min未见收缩张力及振幅回升。与EFS+阿托品组比较，EFS +阿托品+ APTL-SP组在加入APTL-SP后，LES的收缩张力及振幅均下降(P<0.05)；与EFS+阿托品组比较，EFS+阿托品+BTX-A组在加入BTX-A后，LES平滑肌的收缩张力及振幅均进一步下降(P<0.05)，且其抑制效应与EFS+阿托品+APTL-SP及EFS+BTX-A比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 BTX-A抑制外源性SP引发的LES平滑肌收缩 在LES自发性收缩状态下，加入外源性SP后，与对照组比较可迅速引起LES收缩张力及振幅增大(P<0.01或P<0.05)，且持续记录30 min内LES收缩波形未见变化；在SP + APTL-SP组，外源性SP引发LES收缩增强后，加入APTL-SP后可见LES收缩幅度明显下降(P<0.01或P<0.05)。与SP组比较，SP + BTX-A组LES的收缩同样可被外源性SP增强，但其效应可被APTL-SP或BTX-A抑制(P<0.01或P<0.05)，且持续记录30 min内LES收缩波形未见回升。见表2。

表1 BTX-A、APTL-SP对内源性SP引发的LES 收缩的影响

与对照组比较：1)P<0.01；与EFS组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；与EFS + 阿托品组比较：4)P<0.05

表2 BTX-A、APTL-SP对外源性SP引发的LES 平滑肌收缩的作用

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与SP组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

3 讨 论

LES的兴奋收缩主要由肠神经系统内兴奋性神经元释放的ACh、SP等神经递质介导〔6〕；如肠神经系统内调节LES紧张度的抑制性神经元功能受损，则导致其释放的抑制性神经递质减少，而兴奋性神经元释放的ACh、SP等兴奋性神经递质或相对增多，导致LES 紧张度增加，进而出现食管内压力增高、痉挛及松弛不良等贲门失弛缓症状〔7,8〕。近年来，内镜下LES内BTX-A注射治疗贲门失弛缓症逐渐得到重视，推测其机制为抑制平滑肌层内胆碱能神经末梢ACh的释放，进而导致肌肉松弛〔2〕。我们前期研究表明，BTX-A可抑制神经末梢释放的内源性ACh或外源性加入的ACh引发的LES离体平滑肌收缩〔5,9〕。SP可通过与突触后膜上的NK1受体特异性结合，激活Ca2+通道开放，引发外钙内流，增加胞内cAMP水平，导致胃肠道平滑肌收缩；ACh、SP及NO合酶等递质被认为共存于同一个神经元内，在神经元兴奋的同时通过突触前膜的出胞机制同步协同释放出来〔10〕。本研究结果提示BTX-A的抑制效应与抑制突触前膜兴奋性神经递质ACh、SP等释放有关；推测其机制可能为ACh、SP共存于同一个兴奋性神经元的轴突末梢突触囊泡内〔10〕，BTX-A通过裂解SNAP-25蛋白而抑制突触囊泡的移动、融合同时，既阻滞了ACh释放，又抑制了SP的释放。外源性SP的对LES收缩增强效应，在APTL-SP加入后受到抑制，其机制与APTL-SP竞争性与NK1受体结合阻断SP有关〔11〕。本文结果提示BTX-A可能对突触后膜存在抑制效应，推测BTX-A或可直接抑制突触后膜上的NK1受体功能，或具有破坏NK1受体蛋白结构的能力，但其抑制外源性SP发挥效应的机制尚需进一步研究。

1 Dolly JO,Aoki KR.The structure and mode of action of different botulinum toxins〔J〕. Eur J Neurol,2006；13(4):1-9.

2 James AN,Ryan JP,Parkman HP.Inhibitory effects of botulinum toxin on pyloric and antral smooth muscle〔J〕. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2003；285(2):G291-7.

3 Montecucco C,Papini E,Schiavo G.Bacterial protein toxins penetrate cells via a four-step mechanism〔J〕. FEBS Lett,1994；346(1):92-8.

4 周媛媛,李超彦,侯一平.A型肉毒毒素对P物质所致大鼠胃体、胃底离体平滑肌收缩的抑制作用〔J〕.第二军医大学学报,2012；33(10):1074-6.

5 李超彦,于海英,周媛媛,等.A型肉毒毒素抑制外源性乙酰胆碱及P物质引发的大鼠离体食管下括约肌收缩增强〔J〕.第二军医大学学报,2013；34(2):164-6.

6 Metzger M.Neurogenesis in the enteric nervous system〔J〕. Arch Ital Biol,2010；148(2):73-83.

7 Williams VA,Peters JH.A Chalasia of the esophagus:a surgical disease〔J〕. J Am Coll Surg,2009；208(1):151-62.

8 张晓艳,谢鹏雁.食管肠神经系统调控的研究进展〔J〕. 世界华人消化杂志,2009；17(8):790-7.

9 周媛媛,李超彦,楚宪襄.A型肉毒毒素抑制食管下括约肌收缩的实验研究〔J〕. 中国康复医学杂志,2012；27(10):932-3.

10 Shibata C,Sasaki I,Naito H,etal.Effects of substance P on gastric motility differ depending on the sites and vagal innervation in conscious dogs〔J〕. Tohoku J Exp Med,1994；174(2):119-28.

11 杨宝峰.药理学〔M〕.北京:人民卫生出版社,2007:72-5.

〔2015-05-28修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河南省教育厅自然科学研究资助项目(2011C310012)；漯河医学高等专科学校自然科学研究资助项目(2010S11)

周媛媛(1981-)，女，硕士，副教授，主要从事神经、胃肠功能康复研究。

R333.2；R571

A

1005-9202(2017)05-1063-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.010

1 郑州大学基础医学院解剖学教研室