阿尔茨海默病模型大鼠海马组织可塑性变化及其对谷氨酸受体与相关蛋白的影响

魏春杰 王增冕 李桂兰 盛宝英 齐志国

(佳木斯大学附属第一医院神经三科，黑龙江 佳木斯 154002)

阿尔茨海默病模型大鼠海马组织可塑性变化及其对谷氨酸受体与相关蛋白的影响

魏春杰 王增冕 李桂兰 盛宝英 齐志国

(佳木斯大学附属第一医院神经三科，黑龙江 佳木斯 154002)

目的 探讨阿尔茨海默病(AD)大鼠海马组织可塑性的变化及对谷氨酸受体与相关蛋白的影响。方法 50只健康雄性SD大鼠随机分为AD模型组和对照组，每组25只。AD模型组双侧海马注射Aβ1～42，利用水迷宫实验进行入组鼠筛选，建立AD大鼠模型，在基线记录维持40 min后给予能诱发长时程增强(LTP)的高频刺激，记录f EPSP，采用经典的蔗糖密度梯度离心来提取突触小体、支架蛋白和CaMKIIα，分析AD模型大鼠海马组织可塑性变化及对谷氨酸受体与相关蛋白的影响。结果 高频刺激能诱导LTP持续数小时之久。实验中通过刺激海马区侧支旁通路，在CA1区辐射层记录兴奋性突出后场电位，结果显示：海马区组织可塑性变化产生LTP并不依赖于NRB2活性；AD模型组海马区内谷氨酸受体及相关蛋白水平含量显著高于对照组(P<0.05)。结论 采用水迷宫实验能成功建立大鼠AD模型，且海马组织可塑性变化对谷氨酸受体与相关蛋白能产生明显的影响，海马学习记忆机制参与成瘾和戒断引起的行为适应性变化。

阿尔茨海默病(AD)；大鼠海马组织；谷氨酸受体

阿尔茨海默病(AD)属于是一种多因素疾病，涉及多种病理机制，并形成神经细胞凋亡理论。长时程增强(LTP)是一种简单的高频刺激兴奋性输入端引起的突出强度的持续增加，能反映突出可塑性变化中的神经电生理活动的改变〔1〕。本文拟探讨AD模型大鼠海马组织可塑性的变化及对谷氨酸受体与相关蛋白的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年5月至2016年5月健康SPF级雄性SD大鼠50只，体质量102～200 g，平均(153±15)g，周龄6～10 w，动物由医院动物实验室提供，实验过程中对SD大鼠饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导下意见》〔2〕相关规则，许可证号：SCXK 2007-0010。本次临床诊断试验均经医院伦理会批准，大鼠一般资料无统计学差异。将大鼠随机分为AD模型组和对照组，每组25只。

1.2 AD模型鼠的制备 选择双侧海马CA1区作为注射靶点，一次性注射凝聚态Aβ1～42制备AD模型。大鼠腹腔注射浓度为10%水合氯醛(3.5 ml/kg)溶液进行局部麻醉，将大鼠固定在立体定位仪上。采用牙科钻钻开颅骨，利用微量注射器自硬脑膜垂直进针2.8 mm，缓慢注射10 min，留针5 min，每侧注射5 μl，利用水迷宫实验进行入组鼠筛选。利用定位航行实验测量大鼠对水迷宫的学习记忆能力〔3〕。第1天让大鼠自由游泳，上、下午各1次；第2天进行Morris水迷宫测试，将大鼠放置在水迷宫中固定象限，距离池壁20 cm，测试前在大鼠头部涂抹苦味酸标记，并向水池中加入适量的二氧化钛粉，保持安静，室内以恒定日光灯照射，保持水迷宫实验几天位置、环境不变，将大鼠放入池壁水中，1次/d，每次测试120 s，连续测试5 d，对于测试大鼠在120 s内找到平台，则让其停留在平台上15 s完成测试〔4〕。

1.3 LTP记录和LTP诱导 在基线记录维持40 min后采用能诱发LTP的高频刺激：将10个连续的、间隔时间为25的刺激串，每个刺激串包含20个200 Hz的脉冲。记录神经元白发快兴奋性突触后电位(fEPSP)。

1.4 海马组织的匀浆、突触小体的提取和总蛋白浓度测定 采用经典的蔗糖密度梯度离心来提取突触小体。梯度离心主要是指等分离的物质在具备密度阶梯的介质中完成，依靠不同物质不同的密度完成分离。采用蔗糖作为介质，在离心管内形成一个不连续的密度梯度，从上到下依次为0.8 mol/L和1.2 mol/L，将粗提到的组织样本置于蔗糖梯度的顶部〔5〕。在梯度介质中，当被分离的物质分别达到与其密度相同的介质部位时就不再移动，达到分离的目的〔6〕。

1.5 统计学方法 应用SPSS18.0软件进行χ2检验、t检验。

2 结 果

2.1 海马CA1区N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导的LTP不依赖于小鼠单克隆抗体(NR2B)的活性 高频刺激能诱导LTP持续数小时之久。实验中通过刺激海马区侧支旁通路，在CA1区辐射层记录兴奋性突出后场电位，结果显示海马区组织可塑性变化产生LTP并不依赖于NRB2活性，提示大鼠体内长期的海马组织可塑性变化会伴有相关蛋白的表达改变。见图1。

a、b图为基线记录40 min后电刺激兴奋性场电位变化；c图为0.033 Hz测试刺激下的基线40～180 min 图1 海马CA1区NMDA受体介导的LTP不依赖于NR2B的活性

2.2 两组大鼠海马区内谷氨酸受体及相关蛋白比较 AD模型组海马区内谷氨酸受体〔(7.4±0.3)μmol/g〕及相关蛋白CaMK Ⅱα含量(5.31±0.85)显著高于对照组〔(2.1±0.1)μmol/g、1.02±0.23〕(P<0.05)。

3 讨 论

细胞凋亡途径主要有线粒体途径和非线粒体途径〔7〕。在线粒体途径中，细胞内的死亡细胞(如DNA、毒素和ATP耗竭等)均容易引起线粒体释放细胞色素C进入细胞质。而在非线粒体途径中，死亡信号主要依赖于死亡配体和受体的相互结合，从而诱导死亡受体的死亡结构及相关信号分子的转导〔8〕。

脑变化涉及内容相对较多，遍及生命，包括记忆、熟练、情绪及精神疾病和药物的成瘾。这些变化在大脑中是长期的、永久的，部分行为甚至对人能产生较远的影响，临床上将向大脑这样长期的变化称之为神经可塑性。大脑是一个巨大的网络，该网络由1 101神经元组成，承受104输入并发出接近104的信息的输出。而神经元之间的接触或突出的变化更加接近1 015。因此，突触数目的变化及突出效能的变化均会引起神经元可塑性的变化。而LTP是由一种简单的高频刺激兴奋性输入端引起突出强度的持续增强〔9〕。谷氨酸受体在人体海马区中发挥了重要的作用，它属于神经递质受体，兴奋性突出的谷氨酸能与NMDA受体、AMP A受体相互接触。而在突触上，NMDA受体能与多种蛋白复合物形式相互作用，包括神经递质受体、细胞薪附蛋白、细胞骨架蛋白、支架蛋白、信号分子等，NMDA受体能与多种信号通路形成一种复合物共存的NMDA，并且在突触可塑性、学习记忆中发挥了重要的作用。受体在突触上的数目、种类、组成、与不同蛋白间的相互作用以及下游的信号传导通路的改变都组成了神经化学物质活动的改变，从而参与了突触可塑性的改变。本研究临床上对于AD的发病机制、治疗方法及药物的选择等均需要进一步研究和探讨。

本研究采用水迷宫实验能成功建立大鼠AD模型，且海马组织可塑性变化对谷氨酸受体与相关蛋白能产生明显的影响，海马学习记忆机制参与成瘾和戒断引起的行为适应性变化。

1 吴红彦，李海龙，张 云，等.黑逍遥散对东莨菪碱致痴呆小鼠模型的影响〔J〕. 中国中医药信息杂志，2013；20(10)：35-7.

2 Wu J，Bie B，Yang H，etal.Activation of the CB2 receptor system reverses amyloid-induced memory deficiency〔J〕.Neurobiol Aging,2013;34(3)：791-804.

3 亓 珅，杜怡峰.炎性反应在阿尔茨海默病发病机制中作用的研究进展〔J〕.中国神经免疫学和神经病学杂志，2013；20(4)：278-80.

4 宋春未，戴雪伶，姜招峰.阿尔茨海默病实验动物模型研究进展〔J〕.生物学杂志，2013；30(5)：85-8.

5 徐 琴，竺智伟，赵正言.Drebrins 和 Icam-5 在 Fmr-1 基因敲除鼠大脑皮层的表达和意义〔J〕.中华神经医学杂志，2012；11(7)：658-62.

6 陈奕晨，徐红波，胡子成，等.首发未用药抑都症患者血浆氨基酸检测分析及其临床意义〔J〕.第三军医大学学报，2012；34 (14)：1442-5.

7 Sarabdjitsingh RA，Kofink D，Karst H，etal.Stress-induced enhancement of mouse amygdalar synaptic plasticity depends on glucocorticoid and beta-adrenergic activity〔J〕.PLoS One，2012；7(8)：e42143.

8 Zhou M，Hoogenraad CC，Joels M，etal.Combined beta-adrenergic and corticosteroid receptor activation regulates AMPA receptor function in hippocampal neurons〔J〕.J Psychopharmacol，2012；26(4)：516-24.

9 吴定国，李伟华，周志鸿，等.银杏酮酯滴丸在阿尔茨海默病治疗中的应用〔J〕.中国医院药学杂志，2013；33(9)：712-5.

〔2016-10-25修回〕

(编辑 袁左鸣)

黑龙江省教育厅课题(12531699)

齐志国(1972-)，男，主任医师，硕士，主要从事神病学相关临床和基础研究。

魏春杰(1980-)，女，主治医师，硕士，主要从事神经内科临床与基础研究。

R741.02

A

1005-9202(2017)05-1073-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.015