自拟组方补肾固筋方对膝骨性关节炎兔血清及关节液白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α的影响

王恒树 张 冲

(河北医科大学第二医院病理科，河北 石家庄 050011)

自拟组方补肾固筋方对膝骨性关节炎兔血清及关节液白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α的影响

王恒树 张 冲1

(河北医科大学第二医院病理科，河北 石家庄 050011)

目的 观察自拟组方补肾固筋方对膝骨性关节炎(KOA)兔血清及关节滑液白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达及调节机制。方法 选取9个月龄健康雄性新西兰大白兔44只，随机盲法分为正常组、模型组、西药组、中药组，每组11只，除正常组外均采用改良Hulth造模法造模成功后连续给药12 w，取空腹血清及造模膝关节前方部分滑膜组织、股骨内侧髁软骨及软骨下骨及滑液，采用酶联免疫吸附(ELISA)检测血清及关节滑液IL-1、TNF-α的含量及变化。结果 肉眼观察西药组关节间隙狭窄程度介于模型组和中药组之间，关节表面粗糙，软骨下骨赘生成明显；中药组关节间隙较其他各组稍窄，关节表面触之稍粗糙伴轻微骨赘生成；中药组光镜下见软骨细胞大小均匀排列整齐，模型组软骨细胞大小不均且呈簇状排列；模型组血清及关节液IL-1、TNF-α含量升高(P<0.01)。两个给药组与模型组比较血清及关节液IL-1、TNF-α含量降低(P<0.01)，两给药组之间无明显差异(P>0.05)。结论 补肾固筋方可以明显降低血清和关节滑液IL-1、TNF-α的分泌水平。

补肾固筋方；兔膝骨性关节炎；美洛昔康；软骨细胞；白细胞介素-1；肿瘤坏死因子-α

膝骨性关节炎(KOA)以关节软骨变性及骨质增生为病理特征。《素问·痹论》：痹之安生？岐伯对曰：风寒湿三气杂至，合而为痹也〔1〕，治疗多用非甾体类药物或胫骨高位截骨、人工关节置换术〔2〕。中药熟地、枸杞、杜仲、穿牛膝等治疗KOA疗效确切〔3〕。本实验研究补肾固筋方对KOA兔血清及关节液白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达调节机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 44只SPF级雄性9个月龄新西兰大白兔体重2.5～3.0 kg，实验于河北医科大学实验动物中心设施内进行〔动物质量合格证号：scxk(冀)2012-1-004〕，处死动物前经河北医科大学动物伦理委员会同意。适应环境后喂养3 w，室温15℃～25℃，相对湿度45%～60%，每天正常光照，空气流通，标准饲料(组成：麦麸、玉米、大白菜、芹菜)喂养，自由摄食、饮水。

1.2 药物 补肾固筋方组成：熟地20 g、补骨脂20 g、枸杞子20 g、巴戟天15 g、川牛膝18 g、丹参15 g、木瓜10 g、鸡血藤15 g，根据进食欠佳，精神倦怠，喜暖恶寒，活动多少等按中医辨证加减治疗，风寒湿痹加减防风、黄芪、羌活、独活、桂枝；风湿热痹加减秦艽、羌活、茯苓、石膏；瘀血闭阻证加减桃仁、红花、地龙；肝肾亏虚证偏于阴虚者加减枸杞子、山茱萸、川牛膝；偏于阳虚者加减菟丝子、制附子、肉桂；以上药量为成人药量。购于河北省中医院药房，河北省中医院制剂室常规煎煮取汁300 ml，药液浓缩加入蒸馏水后配成6 g/ml；美洛昔康胶囊，7.5 mg，四川宝光药业股份有限公司，国药准字:H20010209批次号：12050277 0265，加入蒸馏水配制成0.5 mg/ml溶液；注射用青霉素G钠(石家庄制药集团有限公司,160 万IU/支，批号：A091136207)；2%利多卡因河北医科大学药理实验室制备。

1.3 试剂及仪器 兔IL-1、TNF-α ELISA试剂盒(IL-1 ELISA Kit Human，TNF-α ELISA Kit，规格：48T/96T)、免疫吸附剂、标记物和显色剂；酶联免疫检测仪(规格：Bio-565)、DNM-9602A酶标分析仪(规格：DNM-9602A)、微量注射器(针头：33G)、移液器均购自上海酶联生化试剂有限公司；德国干燥箱(型号：TG100，产地：Hahn,Dusseldorf,Germany，厂家：Germany RETSCH Company)；恒温水箱(DDIL-5型，上海安亭科学仪器厂)；石蜡切片机(u-641型，美国贝克曼公司)；光学显微镜照相系统(BH-5型，日本Olympus公司)；全自动图像分析系统(Huu-12A型，日本日立公司)；723分光光度计(ELX8086型，美国宝特公司)；数码X线机(CEx86型，美国GE公司)；4%多聚甲醛(山东省寿光市旭东化工有限公司，CAS号：30525-89-4)；灭菌注射用水(5 ml，石家庄第四制药有限公司)。

1.4 动物分组及模型制备 44只新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、西药组及中药组各11只,观察和造模过程后2～3 w内各组均死亡了1只后每组各10只。除正常组外均采用改良Hulth造模〔4〕。2%利多卡因(30 mg/kg)后肢静脉麻醉，常规消毒取血，右后肢膝关节外侧纵切口长约5 cm，逐层切开、分离，探查关节腔无原发病变后，完整切除内侧半月板、前交叉韧带(ACL)，内侧副韧带(MCL)，造成负重力线内移及膝关节不稳。术侧肢体不固定，术后肌注青霉素160万IU·kg-1·d-1，连续8 d，每隔1 d观察创口愈合情况，预防感染。术后第4天即强迫兔奔跑(0.5 h/d)，活动范围约2 h/d。造模2 w后软骨出现改变，6 w后进入平台期，10 w后开始出现典型的晚期OA改变。当胫股关节面正常外翻10°变为内翻，X线片显示下肢力线改变且跛行明显，前抽屉实验和内侧应力实验阳性即表示造模成功。本实验造模成功率为81.3%。

1.5 干预方法 造模成功3 w后干预治疗，采用人与动物的体表面积计算法换算：兔药量(2.5 kg)/d=成人(65 kg)药量/d×0.07×2.5×2/3，美洛昔康药量为6 mg·kg-1·d-1，补肾固筋方药量为53 g·kg-1·d-1，每天两次鼻饲胃管注射；正常组、模型组灌胃15 ml生理盐水，2次/d，连续干预8 w。

1.6 观察指标

1.6.1 步态 采用Coderre法〔5〕步态分级评价。0 级：正常步态，行走时间>5 min；Ⅰ级：轻度跛行，行走时间3～5 min；Ⅱ级：中度跛行，行走时间<3 min。

1.6.2 X线检查 处死动物前拍摄兔膝关节正位和侧位DR片。X线损伤情况按改良David等〔6〕分级，0度：正常；Ⅰ度：可疑；Ⅱ度：肯定；Ⅲ度：明显退变或伴骨质增生。

1.6.3 关节软骨形态学 耳缘静脉空气栓塞处死，1 ml生理盐水灌洗关节腔，取胫骨内侧软骨面并肉眼观察变化，取膝关节前方滑膜组织和股骨内髁关节软骨及软骨下骨，剪成约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm组织块1 min内置于10%中性缓冲甲醛溶液中固定24 h。水冲洗1 h，5%甲酸甲醛脱钙2 w；75%、85%、95%、100%各种浓度乙醇进行逐级脱水；石蜡包埋切片(5 μm)。70℃烤箱内烤片30 min后HE染色，观察关节软骨的层次、软骨细胞及软骨下骨变化。

1.6.4 血清及关节液IL-1、TNF-α检测 取实验结束造模后药物干预8 w空腹处死动物后，立即心脏取血5 ml，3 000 r/min离心10 min分离出血清及关节滑液-60℃冰冻保存；5 000 r/min分离出关节软骨及滑液后，-80℃超低温冰箱保存24 h后再放入液氮(-196℃)保存。采用ELISA检测兔血清及关节液IL-1、TNF-α含量。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0 软件行ANOVA及q检验。

2 结 果

图1 各组骨形态学结果(HE，×40)

2.1 肉眼及镜下观察 见图1。正常组关节软骨蓝白色且色泽透明软骨表面光滑触之较硬，关节液量少；模型组滑膜肿胀明显，软骨表面不光滑，关节边缘与滑膜有少许纤维性粘连凹凸不平，镜下见关节软骨细胞大小不均呈深层簇聚排列；两个给药组关节软骨呈白色触之欠光滑，滑膜轻度增生，关节液较正常组稍多，轻度滑膜炎性改变，镜下西药组软骨细胞排列欠完整，簇状增生；中药组软骨细胞排列完整，相对整齐。

2.2 X线影像学比较 正常组兔膝关节内外侧间隙均匀一致，关节面平整，边缘整齐规则无骨赘，关节内无游离体；模型组膝关节内侧间隙变窄外侧间隙增大，骨囊变、骨赘形成；中药组膝关节内侧间隙狭窄不明显，未见明显骨赘形成；西药组膝关节内侧间隙介于模型组和中药组之间，有轻微骨赘形成。

2.3 IL-1、TNF-α检测 模型组血清及关节液与正常组相比IL-1、TNF-α含量升高(P<0.01)。两个给药组与模型组相比血清及关节液IL-1、TNF-α含量降低(P<0.01)，与正常组相比含量明显降低(P<0.01)，两给药组之间无明显统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组血清及关节液IL-1、TNF-α含量 比较

与模型组比较:1)P<0.01

3 讨 论

KOA的病理机制是关节软骨退变，变性退变的关节软骨表面不光滑，龟裂缺损的范围及深度各有差异〔7〕。研究表明在类风湿关节炎(RA)和骨性关节炎(OA)中均可检测到IL-1的存在；IL-1可促进慢性滑膜炎进一步加重，同时软骨基质降解产物也可刺激滑膜继发炎症形成恶性循环〔8〕，IL-1还可促进软骨细胞分泌前列腺素(PGE)2〔9〕，刺激骨吸收及成骨细胞增生钙化，软骨下骨异常增生形成骨赘〔10〕。OA软骨免疫组化染色的基质及细胞中TNF-α及其受体均呈现阳性，这种阳性强度与范围和OA严重程度呈正比〔11〕；TNF-α促进多形核细胞刺激滑膜细胞PGE2分泌，进而破坏骨软骨，TNF-α可以加速滑膜成纤维细胞样细胞增殖，导致最终滑膜组织纤维素样变性，同时IL-1、TNF-α协同作用加快了膝关节软骨基质的降解〔12〕。

笔者积累多年临床经验参考大量文献自拟补肾固筋方，治则补益肝肾，强筋健骨，以熟地、补骨脂为君药，熟地性微温、味甘，滋阴养血，补骨脂乃补肾壮阳益精填髓之要药，熟地、补骨脂和枸杞子配伍可以改善微循环与血液流变学，通过降低骨内压来缓解骨和骨髓血流动力学及其引起的代谢异常〔13〕，更有利于关节软骨修复；臣药巴戟天、川牛膝和鸡血藤改善软骨细胞功能，促进软骨细胞合成，刺激软骨生发区产生大量幼稚软骨〔14〕，减少或阻断因关节软骨片丢失引起的滑膜分泌〔15〕；木瓜、丹参是活血化瘀药可以促进关节内外的血液循环，改善静脉瘀滞状态，加速血液回流〔16〕。本研究证明补肾固筋方可以有效抑制滑膜炎性改变，减少炎性物质对软骨和滑膜的侵害；同时增强滑膜的渗透作用和关节软骨细胞代偿能力，对软骨皲裂、退变和破坏起到一定的延缓作用；补肾固筋方还通过抑制IL-1、TNF-α的分泌来改善滑膜液性反应，修复并延缓软骨退变、促进软骨修复。本研究虽提供了一定的实验资料阐述了中药复方治疗骨关节炎的作用机制，但仍有不足还需从分子生物学角度进一步探讨PGE2、基质金属蛋白酶(MMPs)及IL-1之间的相互协同作用。

1 国家中医药管理局.中华人民共和国中医药行业标准·中医病证诊断疗效标准〔M〕.南京：南京大学出版社，1999：49-71.

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〔2015-10-04修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河北省中医药管理局指导性课题(No.2014172；No.2015107)

张 冲(1976-)，女，博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事骨科、微创骨科临床科研及教学研究。

王恒树(1975-)，男，硕士，副主任技师，主要从事骨科病因病理学研究。

R274.3

A

1005-9202(2017)05-1079-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.018

1 河北省中医院