雌激素预防切除卵巢大鼠颅内动脉瘤破裂的效果及机制

李 涛 李秀山 计彦新 葛 虹 王红斌

(河北工程大学附属医院神经外二科，河北 邯郸 056002)

雌激素预防切除卵巢大鼠颅内动脉瘤破裂的效果及机制

李 涛 李秀山 计彦新1葛 虹2王红斌3

(河北工程大学附属医院神经外二科，河北 邯郸 056002)

目的 探讨雌激素预防切除卵巢大鼠颅内动脉瘤破裂的效果及作用机制。方法 140只雌性Wistar大鼠随机分为赋形剂组、雌激素治疗组、雌激素+ER受体拮抗剂治疗组、ER-α受体激动剂治疗组、ER-β受体激动剂治疗组、一氧化氮(NO)合成抑制剂N-亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)治疗组、ER-β受体激动剂治疗+L-NAME治疗组，每组20只，均进行切除双侧卵巢+制作动脉瘤模型。醋酸去氧皮质酮(DOCA)-盐型诱导颅内动脉瘤小鼠形成的模型，各组分别于DOCA注射后第6天给予赋形剂二甲基亚砜(DMSO)、17-β-雌二醇、17-β-雌二醇联合ER拮抗剂、ER-α亚型激动剂(PPT)、ER-β亚型激动剂(DPN)、L-NAME、DPN联合L-NAME，大鼠出现动脉瘤破裂症状时处死，或给药持续至DOCA注射后第21天时处死。统计分析各组动脉瘤形成情况以及破裂的动脉瘤发生率和动脉瘤破裂率。结果 雌激素治疗组破裂的动脉瘤发生率及动脉瘤破裂率显著低于赋形剂组和雌激素+ER拮抗剂组，ER-β受体激动剂组显著低于赋形剂组(P<0.05)，ER-α受体激动剂组与赋形剂组比较无显著差异(P>0.05)。与赋形剂组比较，L-NAME组破裂的动脉瘤发生率及动脉瘤破裂率无统计学差异(P>0.05)，ER-β受体激动剂+L-NAME组显著高于ER-β受体激动剂组(P<0.05)。结论 雌激素能够预防切除卵巢大鼠颅内动脉瘤破裂，可能与雌激素刺激ER-β受体激活有关，且这种作用依赖于NO的产生。

雌激素；绝经；颅内动脉瘤破裂

研究表明雌激素可能具有潜在的保护作用，预防绝经后妇女动脉瘤破裂〔1，2〕。已经有动物实验表明，雌激素能够预防动脉瘤的形成〔3〕。然而，目前尚没有实验研究发现雌激素对动脉瘤破裂是否具有预防作用。本研究评估了雌激素和非选择性雌激素受体(ER)抑制剂对切除卵巢的雌性大鼠动脉瘤破裂的影响，其中切除卵巢的雌性老鼠用于模拟绝经后妇女的状况。本研究参考相关文献〔4～6〕，使用一个概括了人类颅内动脉瘤主要特点(包括自发破裂)的颅内动脉瘤大鼠模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 140只SPF级雌性Wistar大鼠，均购自南方医科大学实验动物中心，生产许可证号SCXK粤2006-0015，8～10周龄，体质量(220±20)g。随机分为赋形剂组、雌激素治疗组、雌激素+ER受体拮抗剂治疗组、ER-α受体激动剂治疗组、ER-β受体激动剂治疗组、一氧化氮(NO)合成抑制剂N-亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)治疗组、ER-β受体激动剂治疗+L-NAME治疗组，每组20只，均进行切除双侧卵巢+制作动脉瘤模型。具体方法：称重，3.6%的水合氯醛麻醉，麻醉生效后剪去腹部和腿部鼠毛，并固定于手术台，取下腹正中切口充分暴露膀胱，沿膀胱旁边脂肪中的子宫找到一侧卵巢，结扎切除双侧卵巢，制作去卵巢大鼠模型。止血后关闭腹腔并常规消毒。下一步进行醋酸去氧皮质酮(DOCA)-盐型大鼠模型建立，取脊柱左侧、第12肋下缘切口充分暴露左肾，结扎肾静、动脉，切除左侧肾脏，逐层缝合并常规消毒。大鼠自然苏醒后常规饲养1 w，但饮用1%的生理盐水。术后1 w给予5 mg DOCA溶液皮下注射，2次/w，按照周一、周五间隔给药，连续给药3 w共21 d，自由摄食，饮用1%的生理盐水。

1.2 给药方法 参考相关文献〔5〕，各组于DOCA注射后第6天给药，赋形剂组、雌激素治疗组、雌激素+ER受体拮抗剂治疗组、ER-α受体激动剂治疗组、ER-β受体激动剂治疗组、L-NAME治疗组、ER-β受体激动剂治疗+L-NAME治疗组分别给予赋形剂二甲基亚砜(DMSO)0.17 mg/kg、17-β-雌二醇0.17 mg/kg、17-β-雌二醇(0.17 mg/kg)联合ER拮抗剂(3 mg/kg)、ER-α亚型激动剂(PPT)0.17 mg/kg、ER-β亚型激动剂(DPN)0.17 mg/kg、L-NAME 1 mg/kg、DPN(0.17 mg/kg)联合L-NAME(1 mg/kg)，1次/d。相关试剂均购自上海亨代劳生物有限公司，给药剂量均参照过往文献〔7〕。给药持续至DOCA注射后第21天或处死时。

1.3 动脉瘤破裂和动脉瘤判断标准 出现以下任何症状之一即可判断为动脉瘤破裂〔5〕：①体重减轻(体重减少超过10%且持续24 h)，饮食和饮水明显减少；②躯干弯曲，前肢抬起；③以正常的姿势沿一边绕行；④休息时倾倒在一边；⑤没有自发性的活动。各组出现上述症状后处死，记录处死时的时间，其余未出现症状的于DOCA注射后第21天处死。取同载瘤动脉大脑样本，磷酸盐缓冲盐水灌注，然后灌注包含蓝色染料的明胶显现脑动脉，动脉瘤被定义为局部向外膨胀的血管壁直径大于主动脉直径。

1.4 统计学方法 应用SPSS18.0软件进行χ2检验；绘制生存曲线，采用Log-rank检验进行生存分析。

2 结 果

2.1 造模一般情况 造模过程中赋形剂组、雌激素治疗组、雌激素+ER受体拮抗剂治疗组、ER-α受体激动剂治疗组、ER-β受体激动剂治疗组、L-NAME治疗组、ER-β受体激动剂治疗+L-NAME治疗组分别有1只、3只、3只、8只、5只、5只、4只大鼠死亡。

2.2 雌激素对去卵巢大鼠动脉瘤破裂的影响 赋形剂组、雌激素治疗组以及雌激素+ER拮抗剂组颅内动脉瘤发生率无统计学意义(73.68% vs 76.47% vs 82.35%，P>0.05)，说明雌激素以及雌激素+拮抗剂治疗并未影响颅内动脉瘤发生率；雌激素治疗组破裂的动脉瘤发生率(17.65%)以及动脉瘤破裂率(23.08%)显著低于赋形剂组(63.16%、85.71%)和雌激素+ER拮抗剂组(58.82%、71.43%)(P<0.05)；通过绘制Kaplan-Meier生存曲线并采用log-rank检验发现，在排除未发生动脉瘤的大鼠之后，雌激素治疗组动脉瘤破裂率显著降低(P<0.05)。见图1。

与赋形剂组比较：1)P<0.05；与雌激素+ER拮抗剂组比较：2)P<0.05；同下图 图1 雌激素预防去卵巢大鼠动脉瘤破裂

2.3 雌激素预防去卵巢大鼠动脉瘤破裂作用的受体亚型 赋形剂组、ER-α以及ER-β受体激动剂组颅内动脉瘤发生率无统计学意义(73.68% vs 66.67% vs73.33%，P>0.05)；ER-β受体激动剂组破裂的动脉瘤发生率(13.33%)以及动脉瘤破裂率(18.18%)显著低于赋形剂组(63.16%、85.71%，P<0.05)；通过绘制Kaplan-Meier生存曲线并采用log-rank检验发现，在排除未发生动脉瘤的大鼠之后，ER-β受体激动剂组动脉瘤破裂率显著降低(P<0.05)。而ER-α受体激动剂组(50.00%、75.00%)与赋形剂组(63.16%、85.71%)破裂的动脉瘤发生率以及动脉瘤破裂率均无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 雌激素刺激ER-β预防去卵巢大鼠动脉瘤破裂

2.4 雌激素刺激ER-β依赖于NO的产生 与赋形剂组比较，L-NAME组破裂的动脉瘤发生率(53.33%)及动脉瘤破裂率(61.54%)均无统计学差异(P>0.05)；ER-β受体激动剂+L-NAME组(68.75%，78.57%)显著高于ER-β受体激动剂组(13.33%、18.18%)(P<0.05)。见图3。

与赋形剂组比较：1)P<0.05；与ER-β受体激动剂+L-NAME组比较：2)P<0.05 图3 雌激素刺激ER-β依赖于NO的产生

3 讨 论

本研究结果表明，雌激素能够预防切除卵巢的雌性大鼠动脉瘤破裂，与流行病学研究结果相符合〔1〕。ER-β在人脑动脉和颅内动脉瘤中呈阳性表达，而雌激素的这种预防作用可能与刺激ER-β激活有关。此外，雌激素刺激ER-β保护颅内动脉瘤预防破裂还依赖于NO的产生。本文结果认为雌激素通过刺激ER-β预防颅内动脉瘤破裂。

在切除卵巢的雌性大鼠(即绝经后大鼠)中，发现雌激素刺激ER-β激活保护颅内动脉瘤破裂的作用依赖于NO的产生。与本研究结果类似，诸多研究均表明雌激素的心血管保护效应是由ER-β以NO依赖方式介导的〔8，9〕。ER-β激活不仅可以刺激诱导内皮NO合成酶的表达，同时也能增加NO的生成〔10〕。颅内动脉瘤的病理生理与急、慢性炎症密不可分，而内皮NO合成酶和NO参与了急、慢性炎症的发生和发展〔11〕。NO对各种蛋白质巯基亚硝基化可以防止半胱氨酸残基的氧化修饰，可能减少过度的组织重构，从而降低动脉瘤破裂风险〔9〕。本研究仍然存在一定的局限性：NO合成酶有多种类型，目前尚不清楚哪种类型的NO合成酶能够应答ER-β发挥保护作用，也不清楚是哪种蛋白质巯基亚硝基化。在以后的实验中将利用特定亚型硝酸氧化氮合酶抑制剂以及特定亚型的NO合成酶基因敲除小鼠进一步深入研究。

本研究中另外一个局限性在于使用了8～10 w相对年轻的大鼠。雌性大鼠约在7 w左右进入生殖期，在12～14个月左右进入更年期。多数研究评估雌激素对绝经期的作用均选择8～10周龄卵巢切除的雌性大鼠〔12〕。然而，相对年轻的绝经前卵巢切除大鼠可能并不能完全模拟出正常年长大鼠的更年期生理〔13〕。卵巢切除可导致卵巢激素的突然损失并绕过以雌激素的逐渐损失和波动为特征的围绝经期〔13〕。由于年龄相关的各组织和应答的变化，在生育年龄早期阶段和晚期阶段，卵巢切除和雌激素治疗的效果可能不同〔13〕。此外，在绝经早期和晚期阶段，ER的表达水平、灵敏度以及应答也存在差异〔14〕。更年期会引起雌激素和孕激素缺失，孕激素可以通过调节炎症和氧化应激改善缺血性和创伤性脑损伤动物预后，在神经保护作用方面，孕激素和雌激素可能存在一定的相互作用；此外，睾酮能够激活促炎症因子或调节氧化应激增加炎症反应〔15〕。大脑血管炎症可能受雌激素、睾酮、孕激素之间平衡的影响。

1 de Rooij NK，Linn FH，van der Plas JA，etal.Incidence of subarachnoid haemorrhage：a systematic review with emphasis on region，age，gender and time trends〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2007；78(12)：1365-72.

2 Mhurchu CN，Anderson C，Jamrozik K，etal.Hormonal factors and risk of aneurysmal subarachnoid hemorrhage：an international population-based，case-control study〔J〕.Stroke，2001；32(3)：606-12.

3 Tamura T，Jamous MA，Kitazato KT，etal.Endothelial damage due to impaired nitric oxide bioavailability triggers cerebral aneurysm formation in female rats〔J〕.J Hypertens，2009；27(6)：1284-92.

4 Kanematsu Y，Kanematsu M，Kurihara C，etal.Critical roles of macrophages in the formation of intracranial aneurysm〔J〕.Stroke，2011；42(1)：173-8.

5 Makino H，Tada Y，Wada K，etal.Pharmacological stabilization of intracranial aneurysms in mice：a feasibility study〔J〕.Stroke，2012；43(9)：2450-6.

6 Sugiyama T，Galea GL，Lanyon LE，etal.Mechanical loading-related bone gain is enhanced by tamoxifen but unaffected by fulvestrant in female mice〔J〕.Endocrinology，2010；151(12)：5582-90.

7 Rayner K，Sun J，Chen YX，etal.Heat shock protein 27 protects against atherogenesis via an estrogen-dependent mechanism：role of selective estrogen receptor beta modulation〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009；29(11)：1751-6.

8 Lin J，Steenbergen C，Murphy E，etal.Estrogen receptor-beta activation results in S-nitrosylation of proteins involved in cardioprotection〔J〕.Circulation，2009；120(3)：245-54.

9 Sun J，Picht E，Ginsburg KS，etal.Hypercontractile female hearts exhibit increased S-nitrosylation of the L-type Ca2+channel alpha1 subunit and reduced ischemia/reperfusion injury〔J〕.Circ Res，2006；98(3)：403-11.

10 Banerjee A，Anjum S，Verma R，etal.Alteration in expression of estrogen receptor isoforms alpha and beta，and aromatase in the testis and its relation with changes in nitric oxide during aging in mice〔J〕.Steroids，2012；77(6)：609-20.

11 Hasan DM，Mahaney KB，Brown RD Jr，etal.Aspirin as a promising agent for decreasing incidence of cerebral aneurysm rupture〔J〕.Stroke，2011；42(11)：3156-62.

12 Toutain CE，Filipe C，Billon A，etal.Estrogen receptor alpha expression in both endothelium and hematopoietic cells is required for the accelerative effect of estradiol on reendothelialization〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009；29(10)：1543-50.

13 Mayer LP，Dyer CA，Eastgard RL，etal.Atherosclerotic lesion development in a novel ovary-intact mouse model of perimenopause〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005；25(9)：1910-6.

14 Pinna C，Cignarella A，Sanvito P，etal.Prolonged ovarian hormone deprivation impairs the protective vascular actions of estrogen receptor alpha agonists〔J〕.Hypertension，2008；51(4)：1210-7.

15 Cheng J，Hurn PD.Sex shapes experimental ischemic brain injury〔J〕.Steroids，2010；75(11)：754-9.

〔2016-07-25修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

邯郸市科学技术研究与发展计划项目(No.1523108076-2)

王红斌(1970-)，男，硕士，副主任医师，主要从事脑血管病、颅底外科、脑肿瘤等研究。

李 涛(1978-)，男，主治医师，主要从事出血性脑血管病的介入治疗研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)05-1081-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.019

1 邢台市中医院康复科 2 邯郸市第一医院护理部

3 河北工程大学附属医院神经外科