以神经内肽酶为靶点治疗阿尔茨海默病的人参皂苷有效组分筛选

彭 静 陈 曦 王 宇 罗 亮

(乐山职业技术学院康复基础教研室，四川 乐山 614000)

以神经内肽酶为靶点治疗阿尔茨海默病的人参皂苷有效组分筛选

彭 静 陈 曦 王 宇 罗 亮

(乐山职业技术学院康复基础教研室，四川 乐山 614000)

目的 探讨以神经内肽酶(NEP)作为靶点治疗阿尔茨海默病(AD)的人参皂苷有效组分和筛选方法。方法 构建sweAPP-SK细胞株作为模型细胞；采用Western印迹及ELISA鉴定构建细胞；采用MTT检测人参皂苷组分对SK-N-SH细胞增殖能力的影响；采用NEP肽酶试剂盒测定人参皂苷组分对NEP肽酶活性的影响；采用ELISA检测筛选有效人参皂苷组分对sweAPP-SK细胞株的影响。结果 成功构建高表达APP的sweAPP-SK模型细胞，sweAPP-SK模型细胞Aβ40、Aβ42表达量均较未转染细胞明显增多，差异均具有统计学意义(P<0.05)；人参皂苷组分浓度梯度试验结果显示，各皂苷组分最佳作用浓度分别为皂苷Rg1 20 μmol/L，Rg2 50 μmol/L，Rg3 50 μmol/L，Rb1 50 μmol/L，Re 50 μmol/L；人参皂苷组分时间梯度试验结果显示，最佳作用时间为48～72 h；人参皂苷Rg1、Rg3、Rb1可明显提高NEP活性，分别为对照组细胞酶活性的(124±3.6)%、(131±4.1)%和(121±3.2)%，差异均具有统计学意义(P<0.05)；sweAPP-SK模型细胞经Rg1、Rg3、Rb1作用后，细胞外Aβ40、Aβ42浓度均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 人参皂苷Rg1、Rg3 、Rb1可通过NEP做治疗靶点降低sweAPP-SK细胞株Aβ40、Aβ42的分泌AD的NEP靶点治疗提供依据。

神经内肽酶；阿尔茨海默病；人参皂苷

β-淀粉样蛋白(Aβ)在海马区的沉积是阿尔茨海默病(AD)发病的典型表现，因此，清除或降低Aβ水平是治疗AD的目标之一。体内大部分Aβ通过被中性神经内肽酶(NEP)为代表的一类蛋白酶降解为小分子后从体内清除。另有研究表明，NEP活性降低与脑内Aβ水平升高及AD患者认知功能障碍相关，因此，NEP有可能成为AD治疗的潜在药物靶点〔1〕。人参皂苷(Ginsenoside)是人参中的重要活性成分，可明显改善AD的症状〔2〕，但关于人参皂苷疗效与NEP活性关系的研究尚少。本研究构建了模拟AD患者体内Aβ水平的sweAPP-SK细胞株作为模型细胞，将NEP作为治疗靶点，筛选人参皂苷治疗AD的有效成分。

1 材料和方法

1.1 材料 人参皂苷购于上海融禾医药有限公司；MEM培养基、胎牛血清、兔抗人APP及羊抗兔二抗购于Gibco公司；噻唑蓝(MTT)、增强化学发光法(ECL)发光系、NEP酶切底物及酶抑制剂购于Sigma公司；Aβ40、Aβ42试剂盒购于IBL公司；神经母细胞瘤细胞SK-N-SH购于上海赛百慷生物技术股份有限公司，质粒pcDNA3.1sweAPP由Sigma公司提供技术支持。

1.2 构建sweAPP-SK细胞株 SK-N-SH接种24孔板，长至90%以上融合，弃培养基OptiMEM冲洗，然后用OptiMEM分别稀释pcDNA3.1sweAPP及脂质体后混合，室温孵育，加入细胞，8 h后加完全培养基，隔天换液，3 w挑选单克隆细胞株，即为sweAPP-SK细胞株，继续培养于MEM培养基(含10%胎牛血清和400 μg/L G418)中，长至80%以上融合传代(1∶3)。

1.3 检测方法 (1)MTT检测药物毒性：接种细胞至96孔板(104/孔)，长至60%以上后融合，加入药物继续培养1～3 d，终止培养前4 h每孔加0.5 mg/ml MTT终止培养，弃上清后加入100 μl二甲基亚砜(DMSO)，混匀，检测吸光度(波长600 nm)。(2)Western印迹检测sweAPP-SK细胞株表达情况：sweAPP-SK接种6孔板，培养至90%以上，融合后弃上清，RIPA裂解，提取总蛋白，测定其浓度，电泳(10%SDS-PAGE、硝酸纤维素膜、160 mA/2 h)，封闭(5%脱脂奶粉)，加一抗(室温震荡1 h，4℃过夜)，TBST洗涤后加二抗(室温震荡1 h，洗涤)，ECL试剂盒检测。(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)：细胞接种24孔板，长至60%以上融合，加药，72 h收上清，分别加入Aβ40、Aβ42试剂盒，4℃孵育过夜，Washing buffer冲洗，加二抗(4℃、1 h)，Washing buffer冲洗，加显色物(室温、避光、0.5 h)，加终止液，测定吸光度(波长450 nm)。(4)NEP肽酶实验：细胞接种24孔板，加药(72 h)，弃上清，加缓冲液(SAAP-AMC、Tris-HCl、37℃、1 h)，加phosphoramidon，移至eppendorf管，加APN(20 μl、56℃、1 h)，加丙酮(800 μl)，检测吸光度(激发波长370 nm、发射波长440 nm)；根据各自试剂盒说明绘制标准曲线，计算统计数值。

1.4 统计学方法 应用SPSS15.0软件，符合正态分布的计量资料采用独立样本t检验，不符合正态分布的数据采用秩和检验。

2 结 果

2.1 sweAPP-SK细胞株构建及鉴定 sweAPP-SK细胞株高表达APP蛋白，构建成功。见图1。sweAPP-SK细胞株Aβ40、Aβ42表达量(298.11±15.27，98.35±8.63)均较未转染细胞(44.23±12.46，32.14±3.08)明显增多，分别为转染细胞表达量的6.74倍及3.06倍(均P<0.05)。

2.2 人参皂苷组分对SK-N-SH细胞增殖能力的影响 各皂苷组分最佳作用浓度分别为皂苷Rg1 20 μmol/L，Rg2 50 μmol/L，Rg3 50 μmol/L，Rb1 50 μmol/L，Re 50 μmol/L；皂苷组分时间梯度实验结果显示，最佳作用时间为48～72 h。见表1。

表1 人参皂苷组分对SK-N-SH细胞增殖能力的 影响

与0 μmol/L比较:1)P<0.05

2.3 人参皂苷组分对NEP活性的影响 人参皂苷Rg1、Rg3 、Rb1组NEP活性分别为对照组细胞酶活性的(124±3.6)%、(131±4.1)%和(121±3.2)%(均P<0.05)。

2.4 人参皂苷组分Rg1、Rg3、Rb1对sweAPP-SK细胞株的影响 sweAPP-SK细胞株经Rg1、Rg3、Rb1作用后，培养基Aβ40、Aβ42浓度均明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 人参皂苷组分Rg1、Rg3、Rb1对sweAPP-SK 细胞株的影响

与sweAPP-SK比较：1)P<0.05

3 讨 论

Bormann等〔3〕研究结果显示，遗传、老化等相关因素可引起脑组织内Aβ 积累，并直接导致Aβ 代谢平衡的相应改变，最终导致AD病理过程的启动。因此，寻找和筛选能有效降低Aβ 水平的药物或药物成分对于AD患者的治疗有重大意义。

Iwata等〔4〕研究结果显示，NEP 基因缺陷的小鼠脑组织内Aβ 水平明显上升，而且Aβ 水平升高的程度与NEP 的缺陷程度呈正相关；另有多项研究表明，在转基因AD模型鼠的脑组织中NEP呈过度表达状态，同时可见Aβ水平明显降低，而且呈剂量依赖性〔5，6〕。研究表明，AD患者脑内容易出现Aβ 沉积，形成老年斑，外在表现为NEP mRNA及表达产物含量明显降低，同时可见神经变性斑块部位NEP活性明显降低〔7〕，提示NEP 在降低脑内Aβ水平的过程中可能发挥至关重要的作用，NEP 表达及其活性的增加可以作为AD相关药物研究及临床治疗的新靶点。因此，本研究选择NEP 为靶点进行多项人参皂苷活性成分筛选，结果显示，Rg1、Rg3、Rb1能够显著提高NEP活性。

为了模拟AD患者脑内神经元的真实改变，从而准确有效地检测人参皂苷组分对Aβ 水平的影响，本研究利用脂质体法构建高表达sweAPP的SK-N-SH 细胞作为AD的模型细胞，并命名为swe-APP-SK 细胞。结果显示sweAPP-SK 细胞除了能够高表达APP以外，同时也可以使细胞外Aβ40、Aβ42水平明显升高。然后再以高表达APP 的神经母细胞瘤细胞作为模型细胞进行ELISA 试验，结果显示，人参皂苷Rg1 20 μmol/L，Rg3 50 μmol/L，Rb1 50 μmol/L可以明显降低细胞外Aβ40及Aβ42水平。目前研究结果认为，人参皂苷是人参的重要活性成分，在体内能起到神经保护作用，其中人参皂苷Rb1 是作用于神经系统的主要成分〔8〕，但其对NEP活性影响的相关研究鲜有报道。本研究发现人参皂苷Rb1 能够明显增强神经细胞NEP活性，明显降低细胞外Aβ40 及Aβ42水平。人参皂苷Rg3作为人参的重要成分之一，对于其在神经系统方面的作用，尤其在AD中的作用机制及疗效方面的研究甚少，本研究将人参皂苷Rg3 作用于AD模型细胞swe-APP-SK，研究结果显示，人参皂苷Rg3 也能明显提高神经细胞NEP的活性，同时可以有效降低细胞外Aβ40及Aβ42水平。人参皂苷Rb1同样可以作为人参的有效成分，提高神经细胞NEP的活性、降低细胞外Aβ40及Aβ42水平。

综上所述，本研究在成功构建AD模型细胞swe-APP-SK、筛选出最佳作用浓度和作用时间基础上，发现人参皂苷Rg1、Rg3以及Rb1均可明显提高神经细胞NEP活性，同时可以明显降低细胞外Aβ40及Aβ42水平，为人参皂苷应用于AD的临床治疗提供重要依据。

1 杨玲玲，张 静，崔云燕，等.以神经内肽酶为靶点筛选治疗阿尔茨海默症天然药物的实验研究〔J〕.山东大学学报：医学版，2009；47(1)：10-4.

2 李 源，刘 颖，袁海峰，等.人参皂苷Rg1对阿尔茨海默病模型大鼠脑片磷酸化Tau蛋白及胆碱乙酰基转移酶表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(6)：1640-1.

3 Bormann H，Melzig MF.Inhibition of metallopeptidases by flavonoids and related compounds〔J〕.Pharmazie，2000；55(2)：129-32.

4 Iwata N，Tsubuki S，Takaki Y，etal.Metabolic regulation of brain Abeta by neprilysin〔J〕.Science，2001；292(5521)：1550-2.

5 Marr RA，Guan H，Rockenstein E，etal.Neprily sin regulates amyloid Beta peptide levels〔J〕.J Mol Neurosci，2004；22(1-2)：5-11.

6 Mohajeri MH，Kuehnle K，Li H，etal.Anti-amyloid activity of neprilysin in plaque-bearing mouse models of Alzheimer′s disease〔J〕.FEBS Lett，2004；562(1-3)：16-21.

7 Iwata N，Takaki Y，Fukami S，etal.Region-specific reduction of a beta-degrading endopeptidase，neprilysin，in mouse hippocampus upon aging〔J〕.J Neurosci Res，2002；70(3)：493-500.

8 沈思钰，干振华，傅晓东，等.人参皂苷对神经系统作用的研究现状及分析〔J〕.安徽中医学院学报，2004；23(1)：62-4.

〔2016-04-25修回〕

(编辑 袁左鸣)

乐山市科技局重点研究项目(No.15ZDYJ0150)

陈 曦(1983-)，女，主治中医师，主要从事老年疾病康复研究。

彭 静(1983-)，女，讲师，主治中医师，硕士，主要从事针灸康复治疗老年性疾病研究。

R331

A

1005-9202(2017)05-1089-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.022

1 乐山市市中区人民医院康复科

2 乐山市中医医院针灸康复科