钝挫伤对大鼠骨骼肌卫星细胞体外增殖的影响

唐 芳 高品操 潘同斌

(湖南医药学院体育教研室，湖南 怀化 418000)

钝挫伤对大鼠骨骼肌卫星细胞体外增殖的影响

唐 芳 高品操 潘同斌1

(湖南医药学院体育教研室，湖南 怀化 418000)

目的 研究钝挫伤对大鼠骨骼肌卫星细胞体外增殖的影响。方法 选取24只5周龄Wistar雄性大鼠，随机分为安静对照组(C组)和钝挫伤即刻(D0组)、24 h(D24组)、48 h组(D48组)4组，每组6只。其中钝挫伤组进行钝挫伤的操作后，分别于即刻、24、48 h进行麻醉，与对照组一同摘取左侧腓肠肌，立刻进行肌卫星细胞体外培养。另取新生鼠(N组)2只，宰杀后取下左侧腓肠肌，同样进行肌卫星细胞体外培养。结果 新生鼠骨骼肌卫星细胞增殖最显著，在培养第2天便可见少量纺锤形的单核细胞出现；在第3天就大量增殖，当培养5 d后，卫星细胞相互融合形成多核的肌管；D0组3 d后可见肌卫星细胞，而D24、D48组4 d后可见卫星细胞，到第8天时增殖达到高峰，基本布满大部分培养皿，部分分化融合成肌管，之后增殖速度下降。C组肌卫星细胞含量最少，且增殖速度最慢。结论 钝挫伤对骨骼肌卫星细胞的激活与增殖具有重要作用，且新生鼠体内的肌卫星细胞并未处于静息状态。

骨骼肌；钝挫伤；肌卫星细胞

挫伤后所造成肌肉组织的血肿机化、瘢痕修复严重影响了运动员的运动能力，骨骼肌卫星细胞一旦被激活，细胞一极或两极发生细胞质突起和延伸，并伴随的有丝分裂活动增多、异染色质量降低、质核比率增高和细胞内细胞器数目的增加〔1，2〕。肌卫星细胞是一种肌源性干细胞，具有一定的自我更新能力，它是成体组织内已发生某种程度定向分化的专能干细胞〔3〕。肌卫星细胞可以看作体内潜在的生肌细胞库，当骨骼肌受到创伤或发生病理时，肌卫星细胞可以增殖、分化并迁移至受损肌组织处，彼此相互融合或与原有的肌纤维融合，形成新的肌纤维〔4〕。本文建立钝挫伤模型，研究大鼠骨骼肌卫星细胞的体外培养情况，初步探索骨骼肌损伤修复的机制。

1 材料与方法

1.1 实验分组与取材 选取24只5周龄清洁级雄性Wistar大鼠与2只新生鼠，由扬州大学比较医学中心提供，许可证号：SCXK(苏)2007-0001。24只Wistar雄性大鼠，随机平均分为4组。其中三组进行钝挫伤的操作后，分别于即刻、24、48 h(D0、D24、D48组)进行麻醉，摘取左侧腓肠肌，进行肌卫星细胞的体外培养。余下另一组为安静对照组(C组)大鼠不运动，经麻醉后摘取左侧腓肠肌，进行肌卫星细胞体外培养。新生鼠(N组)2只，宰杀后取下左侧腓肠肌，同样进行肌卫星细胞体外培养。

1.2 钝挫伤模型 本实验采用定量负荷自由落体打击的方法制作骨骼肌钝挫伤模型。大鼠在动物房适应性饲养3 d，3 d后用2.5%戊巴比妥钠以2 ml/kg腹腔内注射麻醉，麻醉生效后，将左后肢褪毛，并置于伸膝、踝背屈90°、稍外展位固定，使小腿后群肌置于胫、腓骨内侧，腓肠肌暴露清楚。参照陈疾忤等人〔5〕的实验，并在此基础上自制重物打击装置，为一金属圆柱体，质量为200 g，底面面积为2.25 cm2，下降高度为36 cm，动能为0.7 J。用自制重物下砸仪从规定高处自由垂直落下打击腓肠肌中段，以2 s的间隔连续击打5次，造模后左后肢明显肿胀，未见瘀血，没有明显的跛行，并注意保护大鼠皮肤的完整性避免感染。经解剖证实了该肌肉钝挫伤模型建立的成功率为100%。

1.3 主要仪器与试剂 超净工作台(苏州净化工作台)；CO2恒温培养箱(赛默飞世尔科技)；光学倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；HH.B-TS-A1型恒温培养箱(长沙医疗器械)；NikonE600显微照相图像采集系统(日本尼康)。新配置的培养基：高糖DMEM培养基(占总量的77%)、胎牛血清(占总量的10%)、马血清(占总量的10%)、Hanks液(占总量的2%)、青-链霉素(占总量的1%)混合制成。

1.4 骨骼肌卫星细胞培养的分离及培养方法

1.4.1 处理组织 分别将取下的各组织在超净工作台中用加有2%双抗的Hanks液清洗至无血，接着用眼科小剪刀剪成1 mm3大小的肉糜。

1.4.2 清洗组织 用Hanks液将组织清洗3遍，静置组织沉淀并缓慢倒出洗液。加入0.25%胰蛋白酶静置组织沉淀并倒掉液体，保留沉淀物。

1.4.3 组织消化 沉淀物中加入约5 ml的0.25%胰蛋白酶，震荡摇匀迅速倒进离心管后塞住瓶塞，放置37℃水浴中消化60 min左右，此过程每隔10 min吹打1次，反复吹打后并出现大量乳白色悬浮絮状物，可加入培养液停止消化。

1.4.4 过滤 将消化液在200目的过滤网中进行过滤，过滤后收集滤液置于2 000 r/min离心10 min，弃上清取沉淀。

1.4.5 纯化 利用肌卫星细胞与成纤维细胞贴壁速度不同，采用连续差速贴壁法纯化肌卫星细胞。取沉淀放入培养瓶，加入适量培养液置于37℃，5%CO2恒温培养箱，预贴壁30 min。差速贴壁的方式贴壁两次，每隔1 h贴壁1次。如在CO2恒温培养箱中取出培养瓶，缓慢倒出培养液，保留沉淀物注入新培养液，放置CO2恒温培养箱中静置1 h后，继续重复注入一次新培养液进行培养。

1.4.6 细胞培养 从静置的培养瓶中缓慢倒出培养液，保留沉淀物注入新培养液，轻微摇匀后倒入被多聚赖氨酸包被的培养皿中进行培养，以后每天换液1次，并用倒置显微镜观察记录。可以持续观察数天并注意细菌感染培养的结果。

2 结 果

2.1 各组培养第2天的卫星细胞状况 C组和D0、D24、D48组中未见到肌卫星细胞，N组可以看见纺锤形的肌卫星细胞。成熟大鼠的正常情况下肌卫星细胞处于静息状态，只有在肌肉损伤或者在病理状态下才能被激活分化增殖，所以在早期钝挫伤组以及正常情况下的对照组均未见肌卫星细胞。N组处于发育时期，可见肌卫星细胞并仍然保持着特异性成肌细胞的活性。见图1。

2.2 各组培养第3天的卫星细胞状况 N组肌卫星细胞数量明显增多，说明新生鼠的肌卫星细胞的增殖能力要明显强于其他组。D0组可见纺锤形的肌卫星细胞，但D24、D48组以及C组仍未见到激活的肌卫星细胞。D24组、D48组与D0组相比，肌卫星细胞还未来得及被激活，可见各组卫星细胞被激活时间以及其增殖数量具有一定差异性。见图2。

2.3 各组培养第5天的卫星细胞状况 N组与D0组均呈现大量纺锤形的肌卫星细胞。D24、D48组以及C组也可见一定数量的肌卫星细胞，并且数量上较前一天均明显增多，表明肌卫星细胞培养第5天开始大量增殖。见图3。

2.4 各组培养第8天的卫星细胞状况 各组肌卫星细胞数量均大量增加且分布比较密集，肌管数量不断增加，最终排列较之前成熟。其中钝挫伤组和N组均出现了融合现象，部分并有微管的出现，说明这三组的肌卫星细胞已发生了分化。培养的第8天已进入了增殖分化高峰期，各组中肌卫星细胞的密度很大，接下来的培养中肌卫星细胞的增殖速度逐渐放缓，没有明显的差异。见图4。

图1 各组培养第2天的卫星细胞状况(×5)

图2 各组培养第3天的卫星细胞状况(×5)

图3 各组培养第5天的卫星细胞(×5)

图4 各组培养第8天的卫星细胞状况(×20)

3 讨 论

卫星细胞是一群有骨骼肌特异性的、不同种类的干细胞和前体细胞，具有成肌潜能和自我更新能力，在出生后骨骼肌的生长、对运动的适应及损伤修复中起着重要作用〔6，7〕。本文对钝挫伤后的骨骼肌卫星细胞进行体外培养来了解骨骼肌损伤修复的过程以及影响骨骼肌修复的相关因素，并揭示骨骼肌损伤的修复机制，为运动性肌肉损伤的康复提供参考依据。本研究显示，钝挫伤对骨骼肌卫星细胞的激活与增殖具有重要作用，且新生鼠体内的肌卫星细胞并未处于静息状态。

1 任玉衡,田得祥,史和福,等.优秀运动员的运动创伤流行病学调查〔J〕.中国运动医学杂志,2000;19(4):377-86.

2 于新凯,晁唯伟,左 群.运动性骨骼肌损伤超微结构变化的研究进展〔J〕.解剖科学进展,2013;19(3):298-302.

3 Buckingham M,Montarras D.Skeletal muscle stem cells〔J〕.Curr Opin Genet Dev,2008;18(6):330-6.

4 Adams GR.Satellite cell proliferation and skeletal muscle hypertrophy〔J〕.Appl Physiol Nutr Metab,2006;31(6):782-90.

5 陈疾忤,陈世益,李云霞,等.骨骼肌钝挫伤后肌电检测的应用研究〔J〕.中华物理医学与康复杂志,2005;27(1):23-5.

6 Le Grand F,Rudnicki MA.Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2007;19(6):628-33.

7 Snijders T,Verdijk LB,Smeets JS,etal.The skeletal muscle satellite cell response to a single bout of resistance type exercise is delayed with aging in men〔J〕.Age(Dordr)，2014;36(4):9699.

〔2015-11-21修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

湖南医药学院校级科研课题(20152KB15)

潘同斌(1965-)，男，教授，硕士生导师，主要从事运动生理与康复研究。

唐 芳(1988-)，女，硕士，主要从事运动保健与瑜伽康复研究。

R873

A

1005-9202(2017)05-1091-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.023

1 扬州大学