16SrRNA基因检测在老年糖尿病烧伤脓毒血症诊治中的价值

刘向荣 李明华 朴春丽 米 佳 刘扬扬

(长春中医药大学，吉林 长春 130021)

16SrRNA基因检测在老年糖尿病烧伤脓毒血症诊治中的价值

刘向荣 李明华1朴春丽2米 佳2刘扬扬2

(长春中医药大学，吉林 长春 130021)

目的 探讨16S核糖体RNA(16SrRNA)基因检测对于老年糖尿病患者烧伤脓毒血症耐药性检测的临床价值。方法 收集老年糖尿病烧伤患者可疑脓毒血症患者41例外周静脉血标本共45份，将每份标本分别进行血常规、C反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-6、-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血液培养以及16SrRNA基因检测，比较两种检测方法对细菌病原体检测的阳性率，以PCR及血培养阴性、阳性患者血常规、TNF-α、IL-6 、CRP、FPG、餐后2 h血糖(2 h PG)、HbA1c的相关性。结果 采用PCR和血培养检测阳性率和操作时间，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。16SrRNA基因检测及血培养方法阳性及阴性标本患者白细胞计数(WBC)、CRP、IL-6、TNF-α水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，且阳性患者明显高于阴性患者，16SrRNA基因检测及血培养方法阳性及阴性标本患者FPG、2 h PG比较差异有统计学意义(P<0.05)，但HbA1c组间比较无统计学意义(P>0.05)。两种检测方法分离病原菌以革兰阴性菌为主，革兰阳性菌低于革兰阴性菌，但是行血培养阴性患者中有部分患者PCR检测阳性。结论 老年糖尿病烧伤患者应早期行血常规、TNF-α、IL-6 、CRP检测、监测FPG、2 h PG变化，一旦有潜在脓毒症风险，行16SrRNA基因PCR检测，判断细菌特征，早期给予抗感染对症治疗。16SrRNA基因PCR检测应用于老年糖尿病烧伤脓毒症患者细菌感染特异性、快速性、敏感性均较高，操作时间短，不受临床应用抗生素的影响。

16SrRNA；糖尿病；烧伤

糖尿病合并烧伤患者由于代谢紊乱，往往出现营养障碍、组织修复及抵抗力降低,糖尿病与烧伤感染二者互为因果，使得老年糖尿病患者合并大面积烧伤后极易发生创面脓毒症，成为提高烧伤救治成功率的一大障碍〔1〕。目前血培养阳性与临床表现不同步，不能作出及时诊断。临床多经验性采取相对应的抗菌药物，待血培养结果回报后对临床用药才起到指导作用〔2〕,16S核糖体RNA(16SrRNA)PCR检测细菌感染为感染性疾病快速诊断提供一个新方法〔3〕。本研究拟分析16SrRNA基因检测老年糖尿病患者烧伤脓毒血症的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014 年1月至2015年1月于烧伤科住院治疗的可疑脓毒症患者41 例,共取得标本45份。其中男35例，女6例，年龄62～80，平均(71.2±4.1)岁，体重(65.2±12.2)kg，火焰烧伤23例，热蒸汽烧伤18例。烧伤面积30%～68%,平均烧伤面积为(46.1±3.6)%，烧伤深度均达到Ⅱ°～Ⅲ°。选取病例标准参照中国医学会制定的烧伤脓毒症临床诊断标准：高度怀疑细菌感染且符合下述前4条中2条以上,且合并有第5条中的任何1项〔4〕： ①体温>39℃或<35.5℃,持续时间超过3 d。②心率>120次/min。③白细胞计数(WBC)>12.0×109/L 或<4.0×109/L,其中中性粒细胞比例超过80%或幼稚粒细胞超过10%。④呼吸频率>28次/min。⑤出现下列临床症状的一种：焦虑抑郁；烦躁、谵语；腹胀、腹泻；消化道出血。在抽取血液标本前所有患者均已使用3 d以上的抗生素。

1.2 标本处理 常规抽取入选患者外周静脉血，送检验科行血培养，检测C反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、血常规、空腹血糖、餐后2 h血糖(2 h PG)、糖化血红蛋白(HbA1c)，抽取6份健康人群的血液标本中，吸取200 μl注入1.5 ml无菌离心管中,然后每管中放入铜绿假单胞菌标准菌株菌落,形成细菌感染的血标本模拟组作为阳性对照。另从此6份健康人的血标本中各吸取200 μl分别注入1.5 ml无菌离心管中,作为阴性对照。将其置于-20℃冰箱中备用。

检查方法:选择酶联免疫吸附法检测CRP、IL-6、IL-10、TNF-α(试剂盒购自上海彩佑实业有限公司)，所有检测操作过程均严格按照试剂盒说明书进行。

将本实验中的45份实验标本分3批次再进行细菌DNA提取、PCR反应及琼脂糖凝胶电泳,每批15份。阴、阳性对照组共 12 份标本为一批，细菌 DNA提取及PCR检测参照具体的试剂盒操作步骤说明进行。16SrRNA细菌通用引物上游引物:5′TTGGAGAGTTTGATCCTGGGCTC3′,在大肠杆菌基因上位置4～25;下游引物:5′ACGTCATCCCCACCTTCCTC3′,在大肠杆菌基因上位置1 174～1 194。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1 两种检测方法的阳性率比较 采用PCR方法检测后19例PCR产物出现1.2 kb长度的条带，为细菌阳性，阳性率为42.22%，血培养中细菌阳性11例(24.44%)，其中9例血培养阳性患者的PCR检测结果也为阳性，另2例PCR检测为阴性，组间比较差异有统计学意义(P<0.05),PCR检测的操作时间〔(4.1±1.1)h〕短于血培养〔(26.5±11.7)h〕(P<0.05)。

2.2 PCR及血培养阴性、阳性患者TNF-α、IL-6 、CRP以及血糖水平比较 PCR及血培养阳性、阴性患者WBC、TNF-α、IL-6、CRP以及FPG、2 h PG水平差异显著(P<0.05)；PCR及血培养阳性患者WBC、TNF-α、IL-6、CRP水平高于阴性患者。两组HbA1c水平无统计学意义(P>0.05)，PCR及血培养阳性患者FPG、2 h PG水平高于阴性患者(P<0.05)。见表1。

表1 PCR及血培养阴性、阳性患者TNF-α、IL-6 、CRP以及血糖水平比较

与PCR阳性比较：1)P<0.05;与血培养阳性比较:2)P<0.05

2.3 烧伤患者PCR及血培养两种检测方法分离病原菌的比较 PCR检测阳性19例患者中革兰阳性菌6例(31.58%)，其中凝固酶阴性葡萄球菌2例(10.53%)，金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、尿肠球菌均1例(5.26%)；革兰阴性菌13例(68.42%)，其中铜绿假单胞菌6例(31.58%)，大肠埃希菌、阴沟杆菌、肺炎克雷菌均2例(10.53%)，鲍氏不动杆菌1例(5.26%)。血培养检测阳性11例患者中革兰阳性菌3例(27.27%)，其中凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌均1例(9.09%)；革兰阴性菌8例(72.73%)，其中铜绿假单胞菌4例(36.36%)，大肠埃希菌2例(18.18%)，阴沟杆菌和鲍氏不动杆菌均1例(9.09%)。

3 讨 论

目前我国老年糖尿病的患病率为 10%～20%〔5〕。老年糖尿病患者由于病程长、体质弱、免疫功能差、血糖控制不良等原因，一旦发生烫伤，开放性的烧伤创面，发热、高血糖、大量渗出给细菌、真菌的定植提供了良好的环境。患者组织器官出现水电解质紊乱，免疫功能在烧伤发生后2 w处于较低水平，受损伤的心肺功能、肾功能不能得到恢复，创面发生感染，容易发生脓毒症。脓毒症是因感染而导致的全身性炎症反应综合征(SIRS)，是烧伤常见并发症。传统的体温、WBC等检测方法难以将其鉴别开来。引起烧伤脓毒症的病原体主要有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等。以往烧伤科医师通常早期应用革兰阳性球菌药物，中期创面以革兰阴性杆菌为主，应用革兰阴性杆菌药物或广谱抗菌药物联合用药，以达到控制创面感染增强疗效，预防和控制脓毒症的发生。但是老年糖尿病患者合并大面积烧伤，身体功能差，脓毒症的发生出现较早，烧伤后患者在应激状态下，胰高血糖素分泌升高，而胰岛素分泌下降，导致血糖升高。大量渗出物为细菌侵袭、生长提供良好培养基，可加重烧伤病情,甚至导致死亡。而烧伤常伴的并发症,如疼痛、毒素吸收、代谢改变及创面感染等，也均能加重糖尿病的病情。临床上选用病原菌敏感的抗菌药物是控制病情发展、降低病死率的关键。

16SrRNA是细菌体内存在特有的rRNA，大约2.9 kb，比真核生物的相应rRNA略小，具有较高保守性,不同种属之间的细菌16SrRNA基因同源性高达97%〔6〕，是原核微生物的标志性基因。通过16SrRNA的基因PCR 扩增,并对扩增产物的分析，便能够对细菌感染的存在进行早期判断。传统对病原菌的分类鉴定主要采用细菌培养，血培养需要分离培养、生化和血清学鉴定，步骤多，操作复杂，受外界和人为影响大，检测周期长，且无法达到较高的阳性率，此外有些细菌常无法得出结果〔7〕,一旦临床应用抗生素后敏感性低，结果滞后于临床的需求，在临床上的使用受到了较大的限制。

本研究发现16SrRNA基因PCR检测对微生物的分离培养不依赖，不受抗菌药物的影响，能够鉴定出死菌和目前人工无法培养的微生物，可以发现微生物新种类。已作为快速诊断某些感染性疾病的“金标准”〔8〕。

由于革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌均能引起脓毒血症，应用广谱抗菌药物或联合用药后容易出现多种药物耐药，由于针对革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌抗菌药物不同，应对细菌作出早期判断。本研究显示PCR的阳性率明显高于血培养方法的阳性率。革兰阳性菌中葡萄球菌比例较高，这可能是因为老年糖尿病患者烧伤后，血糖升高自身抵抗力较差，葡萄球菌大量繁殖，引起感染加重。革兰阴性菌中铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、阴沟杆菌为主，说明老年糖尿病患者烧伤后，血糖升高自身抵抗力较差，条件治病菌大量繁殖，引起感染加重导致脓毒血症的发生为细菌阳性。本研究说明PCR检测技术的敏感性较高。这可能是由于PCR高扩增效率，PCR技术不但能检测到扩增的活细菌,还能检测到扩增的被抗生素杀死而DNA未被遭破坏细菌，但是血培养仅对于活细菌有效。该方法适用于铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的快速鉴定〔9〕，由于16SrRNA基因存在于所有细菌及部分原核生物的染色体基因中，但不存在于病毒、真菌等非原核生物体内。故本研究对真菌的检测出现盲区，还需要血培养的检测。另外，对大肠埃希菌却不完全适用。

TNF-α、IL-6是体内重要的炎症因子， CRP 是机体应激状态时合成的急性期反应蛋白，在机体对炎症、组织损伤、感染等反应中起着重要作用。HbA1c反映患者近8～12 w的血糖控制情况，不受抽血时间、是否空腹、是否使用胰岛素等因素干扰。FPG和2 h PG是反映烧伤后出现感染前后的血糖水平，本研究结果提示在临床工作中一旦发现患者FPG和HbA1c升高异常，就要注意脓毒血症的发生。

1 高 戈,冯 喆,常志刚,等.2012国际严重脓毒症及脓毒性休克诊疗指南〔J〕.中华危重病急救医学,2013;25(8):501-5.

2 曾其毅,宋远斌,陈志江，等.《2012拯救脓毒症运动:严重脓毒症、脓毒症休克诊治指南》儿科部分解读〔J〕.中华实用儿科临床杂志,2013;28(16):1278-80.

3 葛 晨,刘俊行,董士民，等.微小RNA-214对脓毒症小鼠心肌损伤的作用〔J〕.中华急诊医学杂志,2015；24(7):751-5.

4 柴家科.烧伤脓毒症诊断与综合防治策略〔J〕.中华烧伤杂志,2013；29(2):105-8.

5 沈江涌,马 强,杨智斌，等.血清降钙素原与烧伤脓毒症患者血细菌培养类别的关系〔J〕.中华烧伤杂志,2015;31(4):304-5.

6 周岳平,陈晓武,张春新,等.乌司他丁联合血必净治疗烧伤脓毒症的疗效分析〔J〕.中华损伤与修复杂志(电子版),2012;7(1):72-5.

7 许玉玲，王建丽，张爱梅，等.肠道致病菌16S rRNA 基因的快速检测和鉴定〔J〕.现代预防医学，2011;38 (17)：3528-9，3532.

8 陈霖祥，蔡 颖，周广彪,等.16SrRNA 基因快速测序法鉴定3 种常见病原微生物〔J〕.现代预防医学,2014;41(17):3180-3,3200.

9 吕其军，史太阳，周 芳,等.16SrRNA基因检测在脓毒症早期诊断中的研究进展〔J〕.中华医院感染学杂志,2016;26(10):2395-7.

〔2016-11-09修回〕

(编辑 滕欣航)

吉林省卫生计生委课题(20152C027)

朴春丽(1964-)，女，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事糖尿病及其并发症研究。

刘向荣(1990-)，女，在读博士，主要从事糖尿病及其并发症研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)05-1113-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.032

1 吉林省人民医院烧伤科

2 长春中医药大学附属医院内分泌科