DHPLC法分析视黄醇结合蛋白4基因rs17484721及rs36035572多态性与老年人超重肥胖的关系

高静媛 杨雨旸 邢 磊 梁芳倩 于晓龙

(华北理工大学，河北 唐山 063000)

DHPLC法分析视黄醇结合蛋白4基因rs17484721及rs36035572多态性与老年人超重肥胖的关系

高静媛 杨雨旸 邢 磊 梁芳倩 于晓龙

(华北理工大学，河北 唐山 063000)

目的 利用聚合酶链式反应(PCR)-变性高效液相色谱(DHPLC)法对老年人群视黄醇结合蛋白(RBP)4基因的rs17484721和rs36035572位点进行筛查，并分析各基因型之间肥胖、胰岛素及血脂的差异。方法 选择健康查体的汉族老年人304例。检测空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。采用DHPLC技术筛查RBP4基因rs17484721和rs36035572多态性位点,测序分析结果。结果 两个位点的突变存在强连锁不平衡。TT-II组体重指数(BMI)、腰臀比明显高于TC-ID+CC-DD组，考虑TT-II基因型的人群出现向心性肥胖的概率较大。结论 RBP4基因多态性可能与老年人超重肥胖相关。

视黄醇结合蛋白4基因；多态性；超重肥胖；向心性肥胖；胰岛素抵抗

视黄醇结合蛋白(RBP)4基因位于10q23-24,此部位位于CYP2C基因簇中心，有研究显示该区域与2型糖尿病(T2DM)相关〔1〕。人RBP4 基因约10 kb,含6 个外显子和5 个内含子,外显子较短,内含子大小变化很大，非编码区SNP位点可增加糖尿病的易感性，与肥胖、胰岛素抵抗及胰岛素分泌相关。老年人多存在腹型肥胖及胰岛素抵抗，目前尚无老年人肥胖与RBP4基因多态性关系的研究报道。本研究采用变性高效液相色谱(DHPLC)法对RBP4基因rs17484721和rs36035572多态性位点进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取门诊健康查体老年人304例，男157例，女147例，平均年龄65岁，排除严重心肝肾疾病，排除糖尿病、高血压及冠心病。样本采集遵循“知情同意”原则。

1.2 环境危险因素的流行病学调查及临床生化指标检测 采用问卷调查的方式，通过面对面询问，按照统一测量标准,对所有研究对象分别测量身高、体重、腹围、臀围和血压等，抽取空腹静脉血，测定空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、RBP4水平及血清胰岛素(FINS)，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及腰臀比(WHR)。

1.3 分子生物学实验方法

1.3.1 基因组DNA提取 参照文献〔2〕介绍的方法进行。常规抽取研究对象静脉血5 ml，EDTA抗凝,低渗法分离白细胞，SDS-蛋白酶K消化，用苯酚-氯仿法提取白细胞DNA后，溶于TE缓冲液，置-20℃冰箱保存。

1.3.2 PCR扩增 参照GenBank中NT_030059序列自行设计PCR引物，PCR反应条件为：95℃预变性2 min后，95℃30 s,56℃40 s,72℃40 s，共完成30个循环，72℃延伸7 min。产物加载样缓冲液经2%的琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml EB)60 V恒压电泳30 min，紫外透射仪观察结果后，置冰箱4℃保存。

1.3.3 DHPLC分析 参照Jones等〔3〕方法，将PCR产物95℃变性5 min后，以-1℃/s的速度缓慢复性至45℃。置Wavetm核苷酸片段分析系统(美国Transgenomic技术有限公司)96孔板上，输入DNA序列，根据序列用Wavemaker4.0软件选择样品最佳运行温度(60.5℃)和起始洗脱梯度后，自动进样5 μl PCR产物，于DNASep分离柱(Transgenomic产品)用缓冲液A、缓冲液B梯度洗脱，起始梯度为58%B，以每分钟增加1.8%B的速率线性洗脱4 min，流速为0.9 ml/min，从分离柱洗脱的DNA溶液用紫外检测仪检测OD260 nm波长处吸收峰。

1.3.4 DNA序列分析 对DHPLC分析有异常峰型的PCR产物，进行核苷酸序列测定(上海生工测序部)。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件行χ2检验和方差分析。

2 结 果

2.1 DHPLC筛查结果 第一次DHPLC筛查后为单峰，混后DHPLC色谱图为双峰者为两位点发生了纯合突变，见图1。本实验筛选了304例受试者血样，rs17484721位点有T、C两种等位基因，TT、TC、CC三种基因型。rs36035572有I、D两种等位基因，II、ID、DD三种基因型。共获3种不同类型DHPLC色谱图(图1)分别代表三种基因型，即TT-II、TC-ID、CC-DD。其中发现93例为杂和型(TC-ID)；6例为纯合型(CC-DD)；205例为

野生型(TT-II)。

2.2 不同基因型检测指标比较 所有基因型分为两组即TT-II组及TC-ID+CC-DD组，TT-II组BMI及WHR明显高于TC-ID+CC-DD组(P<0.05)，其余指标差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

a杂和突变携带者色谱图；b无突变者色谱图；c纯和突变携带者色谱图(第一次筛选为单峰，第二次混合后是双峰) 图1 DHPLC检测PCR产物的部分结果表1 老年人群RBP4基因的rs17484721和rs36035572位点不同基因型的检测指标比较

组别nBMI(kg/m2)WHRFPG(mmol/L)FINS(mU/L)HOMA-IRTT-II组20525.88±3.910.88±0.084.76±0.6816.71±18.212.57±2.28TC-ID+CC-DD组9922.76±3.431)0.82±0.072)4.61±0.7012.09±9.712.08±2.07组别nTC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)RBP4(mg/L)TT-II组2054.78±1.151.76±0.560.85±0.161.88±0.5918.31±1.14TC-ID+CC-DD组994.58±1.191.67±0.490.90±0.241.85±0.6419.03±1.39

与TT-II组比较：1)P=0.007；2)P=0.031

3 讨 论

迄今国外文献报道已在白种人、蒙古等人群中发现10余种RBP4 基因的突变位点〔4，5〕,这些突变对基因功能的影响各不同，与T2DM、胰岛素抵抗的相关性不一。Munkhtulga等〔6〕研究发现日本人、蒙古人中RBP4的基因表达与脂肪因子及BMI密切相关。Kovacs等〔7〕发现德国健康白人血浆中的FFA浓度与SNP rs3758539,G>A密切相关。本实验发现TT-II基因型老年人群BMI及WHR明显高于TC-ID+CC-DD组。推测TT-II基因型可能与老年人腹型肥胖密切相关。本研究并未发现TT-II，TC-ID+CC-DD组之间血清RBP4水平有明显差异，考虑基因位点的突变没有影响蛋白的转录，推测这种肥胖的遗传倾向与蛋白功能无明显相关性。当然除了基因因素外，影响肥胖的因素很多，我们应继续扩大样本和增加不同种族，提供更多证据，支持这一结论。

1 Kovacs P,Geyer M,Berndt J,etal.Effects of genetic variation in the human retinol binding protein-4 Gene (RBP4) on insulin resistance and fat depot specific mRNA expression〔J〕.Diabetes,2007;56：3095-100.

2 Dong M,Gong YH,Wang L,etal.Application of DNA extraction and analysis of its influence factors〔J〕.Hereditas,2003;25(2):205-7.

3 Jones AC,Austin J,Hansen N,etal.Optimal temperature selection for mutation detection by denaturing HPLC and comparison to single-stranded conformation polymorphism and heteroduplex analysis〔J〕.Clin Chem,1999;45 (8 Pt 1):1133-40.

4 Takebayashi K,Suetsugu M,Wakabayashi S,etal.Retinol binding protein-4 levels and clinical features of type 2 diabetes patients〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,2007;92(7):2712-9.

5 Ost A,Danielsson A,Lidén M,etal.Retinol-binding protein-4 attenuates insulin-induced phosphorylation of IRS1 and ERK1/2 in primary human adipocytes〔J〕.FASEB J,2007;15.

6 Munkhtulga L,Nakayama K,Utsumi N,etal.Identification of a regulatory SNP in there retinol binding protein 4 gene associated with type 2 diabetes in Mongolia〔J〕.Hum Genet,2007;120(6):879-88.

7 Kovacs P,Geyer M,Bemdt J,etal.Effects of genetic variation in the human retinol binding protein 4 gene(RBP4)on insulin resistance and fat dep-ot specific mRNA expression〔J〕.Diabetes,2007;56(12):3095-100.

〔2015-11-14修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河北省医学科学研究重点课题计划(No.20120414)

杨雨旸(1979-)，男，硕士，讲师，主要从事糖尿病并发症研究。

高静媛(1980-)，女，硕士，主治医师，主要从事糖尿病易感基因研究。

R589.1

A

1005-9202(2017)05-1115-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.033