丁香叶黄酮对小鼠药物性肝损伤的保护作用研究

赵常伟 ， 刘芳萍 ， 左咏梅 ， 马 欣 ， 常轶聪 ， 李 睿 ， 李敏敏 ，赫景姗 ， 史晨曦 ， 李 植 ， 蔺月霞 ， 韩 晴 ， 李继昌 ， 高 利

(1.东北农业大学动物医学学院， 黑龙江哈尔滨150030 ； 2. 黑龙江省动物卫生监督所， 黑龙江哈尔滨150001)

丁香叶黄酮对小鼠药物性肝损伤的保护作用研究

赵常伟1， 刘芳萍1， 左咏梅2， 马 欣1， 常轶聪1， 李 睿1， 李敏敏1，赫景姗1， 史晨曦1， 李 植1， 蔺月霞1， 韩 晴1， 李继昌1， 高 利1

(1.东北农业大学动物医学学院， 黑龙江哈尔滨150030 ； 2. 黑龙江省动物卫生监督所， 黑龙江哈尔滨150001)

为确定丁香叶黄酮的保肝作用，将小鼠随机分为5组，即对照组、模型组、丁香叶黄酮高剂量组(40 mg/kg体重)、中剂量组(35 mg/kg体重)、低剂量组(30 mg/kg体重)，以血清转氨酶(ALT、AST)、肝组织指标(MDA、NO、SOD、GSH、GSH-Px)及II相药物代谢酶GSTA1为检测对象，结合小鼠肝脏病理变化综合分析。结果显示，丁香叶黄酮高剂量组血清转氨酶和肝组织中MDA、NO均极显著降低(P<0.01)，SOD、GSH、GSH-Px均极显著升高(P<0.01)，GSTA1的含量也极显著升高(P<0.01)；肝脏组织病理学显示脂肪变性、坏死及炎性细胞浸润减轻；而中、低剂量组的各指标和组织学变化均不如高剂量组明显。研究表明，丁香叶黄酮以40 mg/kg体重剂量对小鼠药物性肝损伤有较好的保护作用。

丁香叶黄酮 ； 醋氨酚 ； 肝损伤 ； GSTA1 ； 小鼠

丁香叶性寒，味苦，入肝、胆、胃三经，有解毒消炎、燥湿、退黄的作用。丁香叶很早在民间就被用作“抗菌消炎、保肝利胆”的良药[1]。研究表明，丁香叶醇溶液的提取物对大肠杆菌等引起的肠炎、腹泻有很好的治疗作用，其有效成分为黄酮和有机酸类[2]。在近代医学，提取自不同植物的黄酮类成分被广泛应用于各种原因导致的肝损伤保护性研究，但没有关于丁香叶黄酮保肝的研究。对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)又叫醋氨酚，是临床常用的解热镇痛药，也是临床重要的非甾体类抗炎药[3]，由APAP诱导的小鼠急性肝损伤是筛选、研究保肝药物首选的经典模型[4]。本研究在课题组前期建立的APAP诱导药物性肝损伤模型的基础上，开展丁香叶黄酮的保肝作用研究，为丁香叶的深度开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明系小鼠，体重(20±2g)，雄性，清洁级，购自哈药集团制药总厂实验动物中心。

1.2 丁香叶黄酮的提取 按本课题组前期建立丁香叶黄酮的提取方案：取10 g丁香叶细粉置于250 mL容量瓶中，加入120 mL无水乙醇、80 mL水，温度50 ℃的情况下用超声波辅助提取30 min后，再回流提取80 min，滤过后用旋转蒸发仪在60 ℃旋蒸至适量体积，70 ℃真空干燥测得其中的丁香叶黄酮1.274 g。按这种方法提取丁香叶黄酮的提取率为12.74%。

1.3 动物分组和给药 将40只小鼠随机分为5组，即对照组，模型组，丁香高、中、低(40 mg/kg体重、35 mg/kg体重、30 mg/kg体重)剂量组，对照组和模型组给予等体积生理盐水。第7天末次给药后禁食12 h，对对照组，各组小鼠分别以APAP溶液200 mg/kg灌胃(按0.1 mL/10 g体重)。禁食不禁水12 h后，将小鼠眼球采血分离血清测定ALT、AST，摘取肝脏，取部分组织制作肝脏病理切片，其余组织用匀浆后测定MDA、GSH、GSH-Px、NO、SOD以及GSTA1。

1.4 各指标的检测方法 ALT、AST、MDA、GSH、GSH-Px、NO、SOD均采用南京建成生物研究所试剂盒，用紫外可见分光光度计(型号UV1901PC)测定。

1.5 GSTA1含量的测定 GSTA1含量测定是采用小鼠谷胱甘肽S转移酶A1 ELISA试剂盒(美国Rapidbio公司生产)试剂盒，用Bio-Rad iMarkTM型酶标检测仪测定，在450 nm有最大吸收值，根据标准曲线和蛋白浓度计算样品中GSTA1含量。

1.6 肝脏病理组织学分析 用福尔马林固定组织标本后，经过脱水、透明、包埋处理，将包埋好的组织块切成5 mm的厚度。按H.E.染色的常规步骤用苏木精-伊红染色，在光镜下进行肝组织的形态学观察。

1.7 统计方法 采用 SPSS19.0软件进行单因素方差分析(Dunnett′s法统计分析)。

2 结果

2.1 小鼠血清中转氨酶ALT、AST活性的变化 小鼠血清中转氨酶ALT、AST活性的变化见表1，与对照组比较，模型组小鼠血清中的ALT、AST极明显增高 (P<0.01)，表明模型复制成功。与模型组相比，丁香叶黄酮高剂量组的ALT、AST极明显降低(P<0.01)，说明40 mg/kg体重丁香叶黄酮可以显著降低APAP肝损伤模型中血清转氨酶的活性。

表1 小鼠血清ALT、AST活性的变化

注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01，下表同

2.2 小鼠肝组织指标MDA、NO、GSH-Px、SOD、GSH的变化 小鼠肝组织指标MDA、NO、GSH-Px、SOD、GSH的变化见表2，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中NO、MDA极显著增高(P<0.01)，GSH-Px、SOD、GSH极显著降低(P<0.01)，表明模型复制成功；与模型组相比，丁香叶黄酮高剂量组的NO、MDA极显著降低(P<0.01)，GSH-Px、SOD、GSH极显著升高(P<0.01)。说明40 mg/kg体重丁香叶黄酮可以明显改善APAP所造成的肝组织的损伤。

表2 小鼠肝组织中NO、MDA、GSH-Px、SOD、GSH变化

MDA(nmol/mgprot)NO(nmol/gprot)GSH⁃Px(U/mgprot)SOD(U/mgprot)GSH(gGHS/L)对照组2．72±0．610．84±0．161380．12±94．8787．87±1．4817．24±1．07模型组4．82±0．66∗∗1．31±0．13∗∗557．88±76．32∗∗57．36±1．29∗∗7．92±0．92∗∗丁香叶黄酮高剂量组(40mg/kg体重)3．51±0．78▲▲0．95±0．03▲▲1077．54±99．88▲▲81．05±1．35▲▲16．49±1．30▲▲丁香叶黄酮中剂量组(35mg/kg体重)5．72±0．39▲▲1．11±0．05▲▲545．86±77．6667．44±1．62▲▲15．13±1．10▲▲丁香叶黄酮低剂量组(30mg/kg体重)6．40±0．461．14±0．04▲417．74±94．24▲58．77±1．248．84±0．49

2.3 小鼠肝组织中GSTA1含量的变化 小鼠肝组织中GSTA1含量的变化见封三彩版图1，与对照组相比，模型组小鼠肝组织中GSTA1含量极显著降低(P<0.01)；与模型组相比，丁香叶黄酮高剂量组GSTA1含量极显著升高(P<0.01)，说明40 mg/kg体重丁香叶黄酮可以明显增加APAP肝损伤模型中肝组织内GSTA1的含量，GSTA1的变化趋势与GSH-Px、SOD、GSH相一致。

2.4 小鼠肝组织病理学分析 小鼠肝脏病理学切片如封三彩版图2所示： APAP模型组(图b和图c)脂肪变性，细胞核裂解、消失，嗜酸性变和炎性细胞浸润；丁香叶黄酮高剂量组(图d)脂肪变性、坏死及炎性细胞浸润减少，说明肝组织受到了保护；中剂量组(图e)也有一定的保肝作用。

3 讨论

研究表明黄酮类化合物对不同类型的试验性肝损伤均有不同程度的保护作用。这种保护作用与黄酮类化合物抗氧化、清除自由基、调节免疫等功能等有关。目前研究肝损伤的常用有血清转氨酶和肝组织指标。本课题组前期研究发现，II相药物代谢酶GSTA1可以作为肝损伤模型的早期诊断指标[5]，因此，本研究也以GSTA1作为丁香叶黄酮保肝作用的评价指标之一。这些指标的变化揭示了APAP打破了肝组织内氧化和抗氧化的平衡。

ALT/AST是反映肝细胞变性损伤情况的常规检测指标。本试验中，模型组ALT和AST极显著升高，且AST/ALT>1，说明模型组肝损伤明显。而丁香叶黄酮高剂量组AST/ALT<1，再次验证了丁香叶黄酮对肝损伤的保护作用。APAP造模对肝脏的损伤使肝细胞内的线粒体遭到严重破坏，AST从线粒体中释放，而丁香叶黄酮可以保护肝细胞内线粒体的损伤[5]。GSH是解除毒素的特效物质，它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，可以与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质排泄出体外；SOD是机体在正常生理状况下惟一能够清除氧自由基的酶，GSH-Px也是谷胱甘肽氧化还原循环中催化GSH氧化的主要酶之一；NO是机体中一种极不稳定的生物自由基；MDA作为脂质过氧化物的终产物具有很强的细胞毒性，其变化可以间接反映出由自由基损伤机体引发出的脂质过氧化的情况。本试验中，丁香叶黄酮高剂量组的GSH、SOD、GSH-Px、MDA、NO的变化说明丁香叶黄酮可以促使肝组织内清除脂质自由基、维持肝细胞的正常功能、排除毒素等。GSTA1是Ⅱ相酶GST的一个亚型，在编码的二聚体蛋白过程中，是机体抗氧化防御系统的重要组成部分，可以催化许多外源性化学物与GSH结合，促进其在细胞内降解清除，达到保护肝脏的目的[6]。本试验中，GSTA1含量的变化说明模型组肝组织内自由基增多、氧化程度明显，而丁香叶黄酮高剂量组肝组织内自由基数量减少，氧化程度减轻，肝细胞膜系统的损伤程度降低，肝脏中GSTA1含量的升高对肝损伤具有保护意义。

本研究表明，丁香叶黄酮对APAP诱导小鼠急性肝损伤有良好的保护作用。在小鼠急性肝损伤时，肝脏中的GSTA1含量呈规律性变化，结合血清转氨酶、肝组织指标及肝组织病理学变化，确定丁香叶黄酮的保肝剂量为40 mg/kg体重。本研究为保肝药物的开发及肝损伤机制的进一步探究提供依据。

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[2] 王洁, 王冬梅, 齐富刚,等. 丁香叶提取物对猪源性大肠杆菌的抑菌作用研究[J]. 饲料工业, 2015，36(14):11-13.

[3] Liu F, Lin Y, Li Z,etal. Glutathione S-transferase A1 (GSTA1) release, an early indicator of acute hepatic injury in mice[J]. Food and Chemical Toxicology, 2014, 71: 225-230.

[4] 刘芳萍, 周琼, 刘颖姝,等. APAP致小鼠急性药物性肝损伤模型建立方法的研究[C]// 中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议论文集，北京：中国毒理学会，2012.

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[6] Liu F P, Ma X, Li M M,etal. Hepatoprotective effects of Solanum nigrum against ethanol-induced injury in primary hepatocytes and mice with analysis of glutathione S-transferase A1[J]. Journal of the Chinese Medical Association, 2016,79:65-71.

Study on protective effects of flavonoids in folium syringaeon drug hepatic injury in mice

ZHAO Chang-wei1, LIU Fang-ping1, ZUO Yong-mei2, MA Xin1, CHANG Yi-cong1, LI Rui1,LI Min-min1,HE Jing-shan1, SHI Chen-xi1, LI Zhi1, LIN Yue-xia1, HAN Qing1, LI Ji-chang1, GAO Li1

(1.College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;2.Animal Health Supervision Institute of Heilongjiang Province，Harbin 150001，China)

To determine the protective effect of flavonoids on folium syringae, mice were randomly divided into 5 groups including control, model, folium syringae high, middle and low dose groups. Serum transaminases (ALT, AST), liver index (MDA, NO, SOD, GSH, GSH-Px) and GSTA1 were analyzed as detection indicators, and tissues were also collected for histopathology.The results showed that serum transaminases, MDA and NO were significantly reduced (P<0.01), and SOD, GSH, GSH-Px and GSTAI were significantly increased (P<0.01).In addition hepatic tissue, fat degeneration, necrosis and inflammatory cell infiltration were reduced in high dose group, while all the changes were less in middle and low dose groups.These results suggest that the folium syringae flavonoids has a protective effect on mice from drug hepatic injury at 40 mg/kg dose.

folium syringae flavonoids; hepatic injury; GSTA1; APAP; mice

LIU Fang-ping

2016-06-29

国家自然科学基金(31472241)；黑龙江省应用技术研究与开发计划项目(PC13S03)

赵常伟(1989-)，男，硕士生，主要从事兽医药理学与毒理学研究，E-mail: 1211164846@qq.com

刘芳萍，E-mail：fangpingliu@126.com

S859.7

A

0529-6005(2017)02-0090-03