盐霉素效价测定的方法优化

韩宁宁 ， 徐 嫄 ， 于丽娜 ， 戴 青 ， 赵 晖

(中国兽医药品监察所， 北京海淀100081)

盐霉素效价测定的方法优化

韩宁宁 ， 徐 嫄 ， 于丽娜 ， 戴 青 ， 赵 晖

(中国兽医药品监察所， 北京海淀100081)

在近期盐霉素标准品制备过程中发现存在抑菌圈过大的问题，导致其相互粘连无法进行效价测定。通过菌株纯化和更换培养基中琼脂品牌及调整其浓度使抑菌圈直径缩小至兽药典规定的范围内。通过上述优化措施保证了国家标准品赋值的准确性，更为同业人员效价测定遇到类似问题提供借鉴。

盐霉素； 效价测定； 抑菌圈过大； 菌株纯化； 琼脂的选择

盐霉素是一种鸡用防球虫剂及仔猪、育肥猪的生长促进剂[1]。1987年欧共体批准使用，1993年中国农业部正式批准使用。它属于聚醚类一元羧酸抗生素，主要作用是通过干扰有害微生物生长，有效控制下痢的发病率和死亡率，提高营养物质的消化和吸收，保证和促进畜禽的健康生长，改善饲料转化率，提高经济效益。由于其结构无紫外发色团，《中国兽药典》中该品种[1]采用效价法测定其含量。兽药典规定三剂量法[2]进行效价测定的抑菌圈直径应为标准品中剂量15～18 mm，在此范围内抑菌圈无相互干扰，效价测定结果准确可信。而近期标准品制备过程中发现盐霉素抑菌圈直径过大，抑菌圈相互粘连影响测定。通过菌株纯化和更换培养基中琼脂品牌及调整其浓度使问题得以解决。

1 材料与方法

1.1 仪器材料与试药 抗生素效价测量仪(北京潮声技术开发公司)；XS205分析天平(Mettler Toledo)。抗生素IV号培养基、pH值6.0的磷酸盐缓冲液及灭菌水均由中海公司提供；盐霉素标准品，购自中国兽医药品监察所，批号K0141106，效价单位948单位/mg。检定菌CMCC(B)63202冻干管，购自于中国食品药品检定研究院。

1.2 抑菌圈过大的解决方法 在效价测定条件摸索阶段，发现盐霉素抑菌圈过大，标准品中剂量抑菌圈直径在26～27 mm，远远超出了兽药典规定的15～18 mm[2]的范围，各抑菌圈相互粘连(如图1)，无法进行测量。按照效价测定的常规思路，采用提高菌浓度和降低抗生素浓度的方法(如表1)以期使抑菌圈直径减小，但抑菌圈依然粘连，无法达到预期效果。且调整后，菌悬液的浓度已经达到效价测定常规菌浓的上限(菌悬液加入量继续增大会影响培养基中各成分的比例)，抗生素浓度也已经接近兽药典规定的线性浓度范围的下限(兽药典规定盐霉素管碟法抗生素浓度范围为10～40单位/mL[2])。因此，拟进一步从菌株纯化和调整培养基中的琼脂两个方面进行摸索。

图1 盐霉素抑菌圈相互粘连效果

1.2.1 菌株纯化 用无菌接种环挑取生长于斜面上的少量检定菌CMCC(B)63202，采用分区平板划线法(如图2)获得典型单菌落。挑取单菌落置斜面培养1周，采用该纯化后的菌株斜面进行效价测定。

图2 分区平板划线法

表1 效价测定的常规条件摸索

1.2.2 更换培养基中的琼脂品牌并调整其浓度 抗生素IV号培养基主要包含蛋白胨，酵母浸出粉，葡萄糖，琼脂和水等5种成分。推测其中的琼脂质量及浓度为影响抗生素扩散的主要因素。因此，在其他几种成分来源及浓度不变的前提下，考察了3种不同品牌的琼脂粉，并参考相应凝胶强度及铺就平皿上层的容易程度确定了其在培养基中的浓度(如表2)。

表2 琼脂粉品牌及浓度摸索

2 结果与分析

2.1 菌株纯化对抑菌圈直径的影响 菌株纯化后，同样采用原液3%菌悬液浓度，标准品中剂量抑菌圈直径由26～27 mm缩小为21～22 mm，虽然仍不在兽药典规定的范围内，但各抑菌圈已不再粘连。说明纯化后非典型菌落去除，短小芽孢杆菌菌悬液中的活性孢子浓度提高，所以即便采用与之前相同的菌悬液浓度仍可使抑菌圈直径缩小。

2.2 培养基中琼脂品牌及浓度对抑菌圈直径的影响 在菌悬液浓度、培养基配方中其他成分的来源及浓度均相同的前提下，发现配方3美国BD公司的琼脂粉浓度为15 g/1 000 g时可以使抑菌圈直径落在兽药典规定范围内(如图3)。

表3 琼脂对抑菌圈直径的影响

3 讨论

3.1 从试验结果可知，即便将菌株纯化且优化了琼脂来源及浓度后，仍然需要原液3%高菌悬液浓度才可以保证抗生素抑菌圈直径落在兽药典规定范围，且接近范围的上限。推测可能是由于菌株冻干粉在存放过程中活力降低，活性孢子量减少所致。

3.2 兽药典中对于效价测定用培养基中琼脂的浓度均规定为15～20 g/1 000 g[2]。而实际配制过程中，除需要参考琼脂粉的凝胶强度外，还需要考察其制备的斜面是否在接种时无侧滑转动、平皿的上层是否在规定温度范围内容易铺就等。而该浓度有可能不在规定范围内。如果完全按照兽药典的琼脂粉规定浓度配制培养基，会导致某些培养基的菌碟上层无法均匀铺就。

[1] 盐霉素钠.中国兽药典委员会.[S].中华人民共和国兽药典二〇一〇年版一部，221.

[2] 抗生素微生物检定法.中国兽药典委员会[S].中华人民共和国兽药典二〇一〇年版一部附录121-128.

Optimization of the Method for the Potency Determination of Salinomycin

HAN Ning-ning , XU Yuan , YU Li-na , DAI Qing , ZHAO Hui

(China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081, China)

During the recent preparation of the reference standard of salinomycin,we found that the diameters of the antibacterial circles were too big so that the potency determination could not be carried out because of their mutual adhesion.Through the strain purification and replacement of the agar in the culture medium and adjustment of the agar concentration,the antibacterial circle diameters were reduced to the scope of the provisions of the veterinary pharmacopoeia.These improvements ensured the accuracy of the assignment of the national standard,and provided the reference for the peers when they meet the same problems during the potency determination.

salinomycin;potency determination;too big diameters of the antibacterial circles;strain purification;selection of agar

ZHAO Hui

2016-09-23

韩宁宁(1984- )，女，助理研究员，硕士，从事抗生素检验工作，E-mail：hnn19841001@126.com

赵晖，E-mail:171977364@qq.com

TQ460.6

A

0529-6005(2017)02-0093-02