瑞替加滨对离体大鼠十二指肠平滑肌收缩功能的影响及其机制

高迪，陈渊锦，刘羽丹，张囡，沙磊

(中国医科大学药学院，沈阳 110122)

瑞替加滨对离体大鼠十二指肠平滑肌收缩功能的影响及其机制

高迪，陈渊锦，刘羽丹，张囡，沙磊

(中国医科大学药学院，沈阳 110122)

目的 探讨瑞替加滨对离体大鼠十二指肠平滑肌收缩功能的影响及其机制。方法 取大鼠十二指肠肠管剪成长度约1.5 cm的肠段，采用BL-420F生物机能实验系统持续记录张力曲线。十二指肠肠管张力曲线稳定后行以下试验：①依次予3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L的瑞替加滨溶液干预，每个浓度作用时间均为15 min，中间用Kreb′s溶液冲洗20 min。测量瑞替加滨干预前及各浓度干预后十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅。②加入10 μmol/L XE-991作用15 min，再加入20 μmol/L瑞替加滨作用15 min。计算瑞替加滨加药前后离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅变化百分率。③加入20 μmol/L瑞替加滨作用15 min，再加入10 μmol/L XE-991作用15 min。比较XE-991加药前后离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅变化百分率。结果 ①瑞替加滨作用下离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅(基线值)变化百分率为100%。各浓度瑞替加滨作用下张力曲线的平均振幅变化百分率均低于基线值，P均<0.05。在6.25～200 μmol/L范围内，随着瑞替加滨浓度增加提高，平均振幅变化百分率逐渐下降，P均<0.05。②瑞替加滨加药前后XE-991孵育的离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅变化百分率无统计学差异，P>0.05。③XE-991加药后瑞替滨孵育的离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅高于加药前，P<0.05。结论 瑞替加滨在6.25～200 μmol/L范围内可呈剂量依赖性抑制大鼠离体十二指肠平滑肌收缩；其机制可能为激活钾离子通道。

瑞替加滨；十二指肠；平滑肌；收缩功能；钾离子通道；体外实验

瑞替加滨是一种治疗成人局限性癫痫发作的新药[1]，主要通过激活电压依赖性钾通道(主要为Kv7.2-7.5通道)发挥作用[2]。瑞替加滨的主要不良反应包括尿潴留、神经精神症状、停药反应、心律失常以及胃肠道不良反应，其中胃肠道不良反应主要有恶心、便秘、消化不良[3，4]。提示在胃肠系统可能存在对瑞替加滨敏感的钾离子通道，瑞替加滨可能通过这些钾离子通道影响胃肠道平滑肌收缩，但查阅文献未见相关报道。2016年10～12月，我们观察了不同浓度瑞替加滨对离体大鼠十二指肠平滑肌收缩功能的影响，以及用钾离子通道阻滞剂XE-991阻断钾离子通道后离体大鼠十二指肠平滑肌收缩功能的变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 普通级成年健康SD大鼠16只，体质量80～220 g，雌雄不限，由中国医科大学实验动物部提供。瑞替加滨(纯度≥98%)购于上海源叶生物有限公司。钾离子通道阻滞剂XE-991(纯度>98%)购于美国Santa Cruz公司。葡萄糖为分析纯，购于天津光复精细化工研究所。胃肠动力测量系统由JZ100型张力换能器和BL-420F生物机能实验系统组成。

1.2 离体十二指肠肠管的制备及实验系统连接 大鼠实验前1 天禁食8 h，不禁水。将大鼠放入CO2麻醉箱中麻醉后处死，立即剖开腹腔，取十二指肠，将肠管剪成长度约1.5 cm的肠段，清除肠系膜及肠道内容物后，将肠管置于充满Kreb′s溶液的恒温槽中，两端分别固定于恒温槽中的固定钩和张力换能器上，张力换能器连接BL-420F生物机能实验系统，由BL-420F生物机能实验系统持续记录张力曲线。Kreb′s溶液温度(36±1)℃，并持续通入含有97%O2、3%CO2混合气。Kreb′s溶液为使用前现配。配制方法为：称取7.02 g NaCl、 0.44 g KCl、0.19 g NaH2PO4·2H2O、1.302 g NaHCO3、2.07 g 葡萄糖溶于800 mL双蒸水中得到溶液1，称取0.244 g MgCl26H2O、0.278 g CaCl2溶于200 mL双蒸水中得到溶液2，将溶液1、2混合均匀即得到Kreb′s溶液。

1.3 不同浓度瑞替加滨对离体十二指肠肠管平滑肌收缩功能影响的观察 待十二指肠肠管张力曲线稳定后，先记录张力曲线15 min，然后在恒温槽中依次加入 3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L的瑞替加滨，每个浓度作用时间均为15 min，中间用Kreb′s溶液冲洗20 min。测量瑞替加滨浓度为0(给药前)、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L时离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅。各浓度瑞替加滨作用下十二指肠肠管张力曲线平均振幅变化百分率=各浓度瑞替加滨作用下十二指肠肠管张力曲线平均振幅/平均振幅基线值×100%。实验重复6次，取均值。

1.4 瑞替加滨对XE-991孵育的离体十二指肠肠管平滑肌收缩功能影响的观察 另取一套实验系统，待十二指肠肠管张力曲线稳定后，加入10 μmol/L的XE-991作用15 min，再加入20 μmol/L的瑞替加滨作用15 min。计算瑞替加滨加药前后离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅变化百分率。实验重复6次，取平均值。

1.5 XE-991对瑞替加滨孵育的离体十二指肠肠管平滑肌收缩功能影响的观察 另取一套实验系统，待十二指肠肠管张力曲线稳定后，先加入20 μmol/L的瑞替加滨作用15 min，再加入10 μmol/L的XE-991作用15 min。计算XE-991加药前后离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅变化百分率。实验重复6次，取平均值。

2 结果

2.1 瑞替加滨对离体十二指肠肠管平滑肌张力的影响 0 μmol/L瑞替加滨作用下离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅(基线值)变化百分率为100%。在3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L瑞替加滨作用下离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅变化百分率分别为(87.4±7.5)%、(70.9±3.9)%、(63.3±9.9)%、(39.0±11.3)%、(30.1±9.3)%、(14.6±2.7)%、(7.1±1.5)%、(8.1±2.8)%。3.125 μmol/L瑞替加滨作用下离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅变化百分率与基线值相比，P>0.05。6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L瑞替加滨作用下，离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅变化百分率均低于基线值，P均<0.05。在6.25～200 μmol/L范围内，随着瑞替加滨浓度提高，离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅变化百分率逐渐下降，P均<0.05。

2.2 瑞替加滨对XE-991孵育的离体十二指肠肠管平滑肌张力的影响 瑞替加滨加药前后XE-991孵育的离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅变化百分率分别为(134.35±13.95)%、(122.28±16.98)%，二者相比P>0.05。

2.3 XE-991对瑞替加滨孵育的离体十二指肠肠管平滑肌收缩功能影响 XE-991加药前后瑞替加滨孵育的离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅分别为(66.11±18.45)%、(86.24±18.80)%，XE-991加药后瑞替加滨孵育的离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅变化百分率高于XE-991加药前，P均<0.05。

3 讨论

研究证明，瑞替加滨参与调控血管、泌尿生殖系统等组织的平滑肌活性[6～8]。本研究结果显示在6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L瑞替加滨作用下，离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅变化百分率均低于基线值。在6.25～200 μmol/L范围内，随着瑞替加滨浓度提高，平均振幅变化百分率逐渐下降，表明瑞替加滨对离体大鼠十二指肠平滑肌收缩具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。证实在大鼠离体十二指肠平滑肌中存在对瑞替加滨敏感的钾离子通道，并且参与调控十二指肠平滑肌的收缩运动。

Kv7型钾离子通道为电压敏感型钾离子通道的一种亚型，主要参与调控细胞膜去极化，从而影响细胞活性[9]。XE-991为非选择性Kv7型钾离子通道阻断剂，研究表明， XE-991可增强胃肠道平滑肌、各种血管平滑肌、子宫平滑肌等[10]的收缩强度，其机制为阻断细胞膜上的钾离子通道，减少钾离子外流，减小静息膜电位，使细胞去极化，增强细胞兴奋性；常作为研究钾离子通道开放剂或者抑制剂相关性质实验的工具药。本研究采用10 μmol/L XE-991验证瑞替加滨对大鼠十二指肠的抑制作用，结果显示，瑞替加滨加药前后XE-991孵育的离体十二指肠肠管平滑肌张力曲线的平均振幅无统计学差异。说明XE-991阻断了瑞替加滨对十二指肠平滑肌收缩的抑制作用。由于XE-991是非选择性钾离子通道阻断剂，故我们认为瑞替加滨对大鼠离体十二指肠肠管平滑肌收缩运动产生的抑制作用是通过激活钾离子通道而实现的。而调换给药顺序，先给予瑞替加滨再给予XE-991，离体大鼠十二指肠肠管收缩幅度增加，表明XE-991可以逆转瑞替加滨对离体大鼠十二指肠平滑肌收缩的抑制作用，进一步证实XE-991和瑞替加滨之间存在竞争性拮抗。Kv7型钾离子通道含有5种亚型，即Kv7.1～7.5,目前已知在小鼠的胃底、胃窦、结肠、盲肠中各型均有表达，但表达量不同，其中Kv7.4、Kv7.5为优势亚型[10]。而在大鼠胃中只有Kv7.1～7.3通道表达，且主要分布在胃窦，在胃体分布较少。可见在不同动物、不同组织中，Kv7各亚型的分布存在差异，各型在大鼠十二指肠中的分布和表达量尚不明确，需要进一步深入研究，确定调控十二指肠收缩运动的亚型。

综上所述，瑞替加滨可抑制SD大鼠离体十二指肠收缩功能，其机制可能与激活钾离子通道有关。该结果提示在十二指肠存在Kv7型钾离子通道，参与调节十二指肠的运动功能，可能成为十二指肠运动障碍性疾病的治疗靶点。

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Effect of retigabine on contraction of smooth muscle of rat duodenum in vitro

GAODi,CHENYuanjin,LIUYudan,ZHANGNan,SHALei

(SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China)

ObjectiveTo investigate the effect of retigabine on contraction of the smooth muscle of rat duodenum and to discuss its mechanism.MethodsThe rat duodenum was cut into segments with a length of about 1.5 cm. We used BL-420F Biological Function Experiment System for tension recording. After tension curve was stabilized, we performed the following experiments and each experiment was repeated 6 times. ① We added 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 150, 200 μmol/L of retigabine into the solution. The recording time of each concentration was 15 min and each concentration was rinsed with Kreb's solution for 20 min. The mean amplitude of the smooth muscle tension of duodenum in vitro was measured before administration and after treatment with different concentrations of retigabine. ② After 10 μmol/L XE-991 was added for 15 min, we added 20 μmol/L retigabine for 15 min. Then we compared the percent of mean amplitude of the smooth muscle tension of duodenum in vitro before and after retigabine. ③ After 20 μmol/L retigabine was added for 15 min, we added 10 μmol/L XE-991 for 15 min. Then we compared the percent of mean amplitude of the smooth muscle tension of duodenum in vitro before and after XE-991.Results① The percent of mean amplitude of the smooth muscle tension of duodenum in vitro before retigabine intervention was 100%. The percents of mean amplitude which were treated with retigabine were lower than that of the control group (0 μmol/L),P<0.05. In the range of 6.25-200 μmol/L, the percent of mean amplitude decreased gradually with the increase of retigabine concentration,P<0.05. ② The percent of mean amplitude of smooth muscle tension which was incubated by XE-991 did not change significantly before and after retigabine intervention,P>0.05.③ The percent of mean amplitude of smooth muscle tension which was incubated by retigabine was higher than that after being given XE-991,P<0.05.ConclusionIn the range of 6.25-200 μmol/L, retigabine can inhibit the contraction of rat duodenal smooth muscle in a dose-dependent manner, and this inhibitory effect may be due to the activation of potassium channel.

retigabine; duodenum; smooth muscle; contraction; potassium channel; in vitro experiment

国家自然科学基金资助项目(81270900，81670492)。

高迪(1988-)，女，助理实验师，硕士，主要研究方向为胃肠动力学。E-mail： dgao@cmu.edu.cn。

沙磊(1964-)，男，教授，博士生导师，主要研究方向为胰腺神经系统及胃肠动力学。E-mail： lsha@cmu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.005

R742.1

A

1002-266X(2017)20-0017-03

2016-12-18)