碱法提取联合高温和酶法改性米糠蛋白的研究

李帅斐,赵安琪,杨 末,于 雷,汪 洋

(吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118)

碱法提取联合高温和酶法改性米糠蛋白的研究

李帅斐,赵安琪,杨 末,于 雷*,汪 洋

(吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118)

以脱脂米糠为原料,氮溶指数为指标,通过均匀设计优化碱法提取联合高温和酶法改性米糠蛋白工艺。得到最优条件为:提取温度50 ℃,高温改性时间4 min,酶解时间120 min,改性后的米糠蛋白氮溶指数达到96.08%。在该条件下,改性米糠蛋白的持水性、持油性、乳化性和乳化稳定性分别提高了15.8%、165.7%、48.9%和84.7%。通过对米糠蛋白游离巯基和二硫键含量测定和SDS-PAGE电泳分析表明,碱法提取联合高温和酶法改性米糠蛋白可使米糠蛋白中二硫键含量减少,游离巯基含量增加,蛋白水解,溶解度增加,从而改善其功能特性。

米糠蛋白,提取,改性,氮溶指数

米糠是水稻加工过程中的副产物,产量巨大,但一般用作饲料和肥料,其利用价值大大降低。米糠含有12%～22%的蛋白质,蛋白质含量仅次于燕麦而远高于小麦和玉米[1]。米糠蛋白是一种优质廉价的植物蛋白,蛋白的氨基酸配比合理平衡,与FAO/WHO推荐模式相近,其中含有较多的赖氨酸,生物价高,具有较高的吸收率,这些是其他植物蛋白无法比拟的[2-3]。米糠蛋白是已知谷物中过敏性最低的蛋白质,可用于婴幼儿食品中[4]。另外,米糠蛋白还具有降低胆固醇、抗动脉粥样硬化、抗疲劳和抗癌等作用[5]。

米糠蛋白的功能性质决定了其在食品中的应用,因此,有必要对米糠蛋白进行深入研究,使其能够满足食品加工的需要。大量研究发现,蛋白质的功能性质与溶解性关系密切,溶解性是持油性、乳化性和乳化稳定性的主要决定因素,随着蛋白质溶解度的提高,蛋白质的持油性、乳化性和乳化稳定性也会得到相应提高[6]。氮溶解指数(nitrogen solubility index,NSI)是蛋白质溶解度的常用表示方法之一。目前,国内外对蛋白的提取主要采用碱法、酸法、酶法、盐法和醇法,其中碱法提取时,碱能水解米糠中的氢键、酰胺键和二硫键,从而释放更多的蛋白质,米糠蛋白的提取率大大提高[7]。在蛋白质改性方面,物理改性费用低、作用时间短、无毒副作用及对产品营养性能影响小[8];酶法改性具有条件温和,有害副产物少等优点。本文采用碱法提取联合高温和酶法改性米糠蛋白,酶法改性使用碱性蛋白酶,米糠蛋白提取和改性始终处于碱性环境,实验连续进行,操作简便。通过测定游离巯基和二硫键含量以及电泳分析初步研究了米糠蛋白结构和功能性质的关系,为改性米糠蛋白在食品中的应用提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜米糠(含蛋白质15.66%) 吉林省万昌米业有限公司;品上品笨榨大豆油 市售;碱性蛋白酶(酶活 20万U) 上海源叶生物科技有限公司;牛血清白蛋白 盐城赛宝生物科技有限公司;电泳试剂盒(WB-0201) 北京鼎国昌盛生物技术有限公司;考马斯亮蓝R250、Tris、SDS、甘氨酸 电泳级;其他试剂 均为分析纯。

TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;DYCZ-24D电泳槽 北京六一仪器厂;PHS-3D pH计 上海精密科学仪器有限公司;FD-1B-80冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;RH-800粉碎机 浙江荣浩工贸有限公司;BSA124S-CW分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;JY04S-3C凝胶成像仪 北京君意东方电泳设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米糠蛋白的提取 用粉碎机将新鲜脱脂米糠粉碎,过100目筛,取米糠粉20 g加入180 mL水,搅拌均匀,调节pH为10,在设定温度下提取90 min。然后在4000 r/min转速下离心20 min,得到上清液[9]。

1.2.2 改性米糠蛋白的制备 将上述上清液调节pH至4.5,在4000 r/min离心20 min,弃去上清液,将沉淀冻干备用,得到碱提蛋白;

将上述上清液在95 ℃下加热一定时间,冷却至室温,再调节pH至4.5,在4000 r/min离心20 min,弃去上清液,将沉淀冻干备用,得到高温改性蛋白;

将上述上清液加入4000 U/g的碱性蛋白酶,在60 ℃和一定pH条件下酶解一定时间,灭酶并冷却至室温,最后调节pH至4.5,在4000 r/min离心20 min,弃去上清液,将沉淀冻干备用,得到酶法改性蛋白;

将上述上清液在95 ℃下加热一定时间,冷却至60 ℃,加入4000 U/g的碱性蛋白酶在酶解一定时间,灭酶并冷却至室温,最后调节pH至4.5,在4000 r/min离心20 min,弃去上清液,将沉淀冻干备用,得到高温和酶法联合改性蛋白。

1.2.3 实验设计 通过预实验得到对米糠蛋白氮溶指数影响最重要的三个因素:提取温度、高温改性时间和酶解时间。采用均匀设计实验来优化提取改性的最优条件。实验因素和水平见表1。

表1 均匀设计实验因素与水平

根据3因素和5水平,选取均匀设计表U5(53),进行五组实验,以NSI为指标选出最优的条件。

1.2.4 NSI的测定 改进刘颖等[10]的方法,取20 mL水解液,加蒸馏水至50 mL,在25 ℃下振荡2 h,然后定容至100 mL,混匀后静置2 min,将上层液体在4000 r/min转速离心10 min,取上清液用Folin-酚法测定蛋白含量,根据下式计算氮溶指数NSI:

式(1)

式中:A-上清液中蛋白质质量;B-测定前蛋白质质量。

1.2.5 持水性的测定 准确称取m1(约为0.5 g)的米糠蛋白样品至已知质量m2的离心管中,再加10 mL的蒸馏水,混合均匀后在室温下静置30 min,然后在4000 r/min转速下离心10 min,弃去上清液,将沉淀和离心管一起称重,记为m3,持水性为每克米糠蛋白结合水的克数,如下式(2)计算持水性[11]。

式(2)

1.2.6 持油性的测定 准确称取米糠蛋白样品m1(约0.6 g)于已知质量m2的离心管中,加入4 mL大豆油,用玻璃棒轻轻搅拌至无明显颗粒,再用移液管取2 mL大豆油冲洗玻璃棒和离心管壁,在4000 r/min转速下离心20 min,除去上层未吸附的大豆油,最后称量离心管和沉淀总质量,记为m3。按下式(3)计算蛋白质的持油性[12]。

式(3)

1.2.7 乳化性和乳化稳定性的测定 改进江志炜[13]的方法,准确称取0.25 g蛋白样品,加入0.1 mol/L pH为7.5的磷酸盐缓冲液20 mL,然后再加入10 mL大豆油,于均质机中均质2 min,立即从容器底部吸取50 μL,加入7 mL 0.1%的SDS溶液,混匀后在500 nm波长处测定吸光度值,以SDS溶液作为空白。室温放置10 min后再次从底部取样测定。米糠蛋白的乳化性(EAI)及其乳化稳定性(ESI)分别按下式(4)和式(5)计算:

式(4)

式(5)

式中:C-样品浓度(g/mL);φ-乳化液中油相的比例;ΔT-为10 min;L-比色杯光径;A0-初始乳化液的吸光度值;A10-10 min时乳化液吸光度值。

1.2.8 巯基和二硫键含量的测定 采用罗明江等的Ellman’s试剂比色法[14]。

1.2.9 SDS-PAGE电泳 采用15%的分离胶和5%的浓缩胶对改性前后的米糠蛋白进行电泳分析。先采用100 V,50 mA,当条带移动到分离胶时改为120 V,80 mA。结束后采用考马斯亮蓝R-250进行染色1 h,然后用脱色液进行脱色。待脱色完全后,利用胶凝胶成像仪进行照相。

1.2.10 数据处理 该实验中相关的实验均设3次重复,实验结果取平均值。数据采用SPSS 17.0分析软件进行分析,设置显著性水平设置为p<0.05。

2 结果与分析

2.1 Folin-酚法测定蛋白的标准曲线

以牛血清白蛋白作为标样,绘制蛋白的标准曲线,见图1。根据标准曲线可以计算出均匀设计中各组实验的NSI,再根据NSI进行最优组合的选择。

图1 Folin-酚试剂法测蛋白的标准曲线Fig.1 Standard curve to measure protein in Folin-phenol reagent method

2.2 均匀设计实验

表2为以NSI为指标的均匀设计实验结果,利用回归分析法对表2的实验数据进行回归分析可知,实验指标氮溶指数NSI与3个因素之间满足线性关系。利用Excel进行回归统计的结果见表3。

表2 均匀设计实验结果

表3 回归分析结果

注:复相关系数R=0.9999,R2=0.9999,significanceF=0.008274013,*表示影响显著,**表示影响极显著。

由表3的复相关系数R=0.9999,R2=0.9999,以及方差分析结果significanceF<0.01,说明该回归方程非常显著。由表3分析结果可知,回归方程可写为:

y=85.96+0.119A-1.93B+0.1015C

对偏回归系数进行t检验时,︱t︱越大,所对应的偏回归系数越显著,相应的因素也越重要。根据表3中t检验的结果,可知因素的主次顺序为B>C>A。即高温改性时间>酶解时间>提取温度。由回归方程可知,A和C的系数为正,表明实验指标氮溶指数随着因素A提取温度和C酶解时间的增加而增加;B的系数为负,说明氮溶指数随着因素B高温改性时间的增加而减小。可能是由于当提取温度适当增加时,蛋白分子的构象轻微的改变,立体结构伸展,有利于蛋白分子和水分子的运动和相互作用,从而起到了增溶的作用;高温改性时间作用过长,米糠蛋白部分变性,破坏了空间结构,分子内部的疏水基团暴露,分子间相互凝结沉淀,从而起到减溶的作用[15]。酶法改性是通过切断或者修饰蛋白质的氨基酸侧链及肽链,去除蛋白质的疏水性基团,破坏高级结构,随着酶解时间的增加,蛋白质大分子变小,更多的亲水性氨基酸残基能够遇水接触,达到增溶的作用,但是水解时间过长会造成过度水解,使高级结构破坏而致使其他功能特性下降[16]。所以,在确定最优方案时,因素A提取温度和C酶解时间的取值应偏上限,因素B高温改性时间的取值应偏下限,再根据实验情况和以上综合因素,得到优方案为:提取温度50 ℃、高温改性时间4 min、酶解时间120 min。将以上各值带入回归方程得到氮溶指数y=96.37%,这一结果高于表2的五个结果。

2.3 均匀设计验证实验

按照上述的优化结果即提取温度50 ℃、高温改性时间4 min、酶解时间120 min进行三次重复实验,得到米糠蛋白的氮溶指数平均值为96.08%,与预测值基本吻合。联合改性米糠蛋白的提取率为74.63%,纯度为71.75%。

2.4 改性前后米糠蛋白的持水性和持油性比较

从图2可以看出,以碱法提取的米糠蛋白作为对照,高温改性使米糠蛋白的持水性增加,酶法改性使持水性降低,而高温和酶法联合改性使米糠蛋白的持水性增加。这可能是因为加热破坏了米糠蛋白原有的具有高度规则性及紧密排列方式的蛋白质肽链,变为不规则的松散排列方式使持水性增加[17];在碱性蛋白酶的作用下,米糠蛋白逐渐由大分子变为小分子,其氮溶指数增加,更多的蛋白溶于水中,使米糠蛋白的持水性降低[18]。在高温和酶法联合改性时,高温改性弥补了酶法改性的这一缺点,联合改性使米糠蛋白持水性升高。

图2 碱提蛋白与三种改性蛋白的持水性和持油性比较Fig.2 Comparison on water and oil holding capacity of alkaline extraction protein and three modified proteins

蛋白的持油性与物理截留作用关系密切,高温和酶法改性后,由于热的作用,埋藏在球状分子内部的非极性侧链由于离解和开链导致转向蛋白质分子表面,酶解的作用也是蛋白分子适度展开并由大分子变为小分子,比表面积变大,进而对油脂截留作用变大,最后使米糠蛋白具有较高的持油能力。高温改性和酶法改性都使米糠蛋白的持油性增加,而高温和酶法联合改性使米糠蛋白的持油性达到最高。

2.5 改性前后米糠蛋白的乳化性和乳化稳定性比较

由图3可以看出,高温和酶法联合改性使米糠蛋白的乳化性和乳化稳定性最高。乳化性是指蛋白质将油和水结合在一起形成乳状液的能力,由于可溶性蛋白质能够扩散并吸附在油/水界面是决定蛋白质乳化性质的重要特性之一,因此蛋白质的高溶解度对其乳化性非常有益[19]。乳化性和乳化稳定性增加的原因可能是高温和酶法联合改性后米糠蛋白的氮溶指数显著增加,溶解性的增加使溶液中的蛋白浓度增加,增加界面膜的厚度,从而提高膜的强度,增加米糠蛋白的乳化性及其稳定性[20]。

图3 碱提蛋白与三种改性蛋白的乳化性和乳化稳定性比较Fig.3 Comparison on emulsification and emulsion stability of alkaline extraction protein and three modified proteins

2.6 巯基和二硫键的变化

米糠蛋白的溶解性差是因为其蛋白分子之间有较强的聚合和大量的二硫键交联。由图4可以看出，通过高温改性之后,米糠蛋白游离巯基和二硫键变化不明显,可能是由于加热使米糠蛋白分子紧密结构发生适度的展开,但二硫键没有破坏。这与高温改性米糠蛋白的持水性增加相一致。酶法改性使米糠蛋白的游离巯基增加,二硫键大大减少,这与酶法改性使米糠蛋白大分子裂解,氮溶指数增加,乳化性和持油性增加相一致。这是由于碱性蛋白酶对米糠蛋白分子的酶解作用,使蛋白由大分子变为小分子,使二硫键断裂,游离巯基增加。高温和酶法联合改性米糠蛋白,二硫键含量减少和游离巯基含量增加的效果比酶法改性明显,说明联合改性破坏了米糠蛋白的二硫键,有利于米糠蛋白的溶出使溶解性提高,乳化性和乳化稳定性增强;有利于规则紧密的肽链松散使持水性和持油性增加。这可能是由于高温导致蛋白分子的展开,蛋白的展开增加了酶跟底物接触的可能性,进而有利于酶解[21]。

图4 碱提蛋白与三种改性蛋白的游离巯基和二硫键比较Fig.4 Comparison on free thiol groups and disulfide content of alkaline extraction protein and three modified proteins

2.7 SDS-PAGE电泳

由图5可知,与碱法提取蛋白相比,高温改性蛋白分子量变化不明显,而酶法改性蛋白和高温及酶法联合改性在大分子区明显减少,在小分子区明显增多,改性后米糠蛋白分子质量主要为14.4 kDa以下,有利于米糠蛋白的消化吸收。这说明高温改性使米糠蛋白分子展开;酶法改性使米糠蛋白分子由大分子变为小分子,这对高温改性降低溶解性,酶法改性增加溶解性,提高持油性、乳化性和乳化稳定性做出了解释。由于高温和酶法联合改性使米糠蛋白分子裂解,蛋白由大分子变为小分子,有利于氮溶指数的提高,高溶解度使溶液中米糠蛋白的浓度提高,从而使其乳化性和乳化稳定性增高。高温和酶法联合使米糠蛋白变性,暴露了许多内在基团,如肽键和极性侧链,从而使得蛋白质的亲水性和亲油性都得到了提高[22]。

图5 碱提蛋白与三种改性蛋白的电泳图比较Fig.5 Comparison on electrophoresis of alkaline extraction protein and three modified proteins注:M. Marker,1.碱提蛋白,2.高温改性蛋白,3.酶法改性蛋白,4.高温酶法联合改性蛋白。

3 结论

通过均匀设计实现了对米糠蛋白的碱法提取与高温和酶法联合改性工艺的优化,得到了最佳工艺条件:提取温度50 ℃,高温改性时间4 min,酶解时间120 min。碱法提取联合高温和酶法改性米糠蛋白,使米糠蛋白的溶解性、持水性、持油性、乳化性和乳化稳定性得到了显著提高。这是由于提取与改性共同作用可使米糠蛋白中二硫键含量减少,游离巯基含量增加,米糠蛋白大分子转变为小分子所致。

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Study on alkaline extraction joint heat and enzymatic modification of rice bran protein

LI Shuai-fei,ZHAO An-qi,YANG Mo,YU Lei*,WANG Yang

(College of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)

The rice bran protein was alkaline extracted jointing with heat and enzymatic modification by using fresh defatted rice bran as raw materials and nitrogen solubility index as index. The process was optimized by uniform design. The best conditon parameters were as follows:extraction temperature 50 ℃,heat modification time 4 min and enzymatic reaction time 120 min. The nitrogen solubility index of modified rice bran protein reached 96.08%. Under the optimum conditions,water absorption,oil absorption,emulsion and emulsion stability were increased by 15.8%,165.7%,48.9%and 84.7%,respectively. Finally,free thiol groups and disulfide bonds determination and SDS-PAGE electrophoresis indicated that alkaline extracted and heat and enzymatic modified rice bran protein increased its functional properties by decreasing disulfide bonds,increasing free thiol groups,which led to the hydrolysis of rice bran protein and improvement of solubility.

rice bran protein;extraction;modification;nitrogen solubility index

2016-07-25

李帅斐(1990-)，男，硕士，研究方向：食品科学，E-mail:704609828@qq.com。

*通讯作者:于雷(1973-)，男，博士，教授，研究方向：食品科学，E-mail:354038827@qq.com。

TS201.1

A

1002-0306(2017)06-0153-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.021