微渠表面多孔羟基磷灰石支架体内异位成骨性的研究

吕欣荣，温永梅 ，伍 佳，牟雁东，2(.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院口腔种植科，四川 成都 60072)

微渠表面多孔羟基磷灰石支架体内异位成骨性的研究

吕欣荣1，温永梅1，伍 佳1，牟雁东1，2
(1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院口腔种植科，四川 成都 610072)

目的 通过进行体内非骨区域植入实验，评价微渠结构对多孔羟基磷灰石支架体内骨诱导性的影响。方法 选取4只比格犬的背部肌肉为实验区，分为微渠结构的羟基磷灰石支架(HAS-G)组和非微渠结构的羟基磷灰石支架(HAS)组，每组各两只犬，分别植入HAS-G和HAS。并于植入1月和3月时处死后取出背肌内植入样本，进行组织学检查、力学检测；比较两组支架内新骨形成情况，评价微渠结构对多孔羟基磷灰石支架体内异位成骨骨诱导性的影响。结果 两组在背肌内均可形成新骨，但各个时间段内在HAS-G中形成的新生骨数量及新生血管数量均多于HAS。在抗压强度测试中HAS-G也优于HAS。结论 与HAS比较，HAS-G表现出明显的力学和生物学优势，具有良好的应用前景。

微渠；多孔羟基磷灰石；支架；骨诱导性

目前，临床上口腔种植治疗时还存在着一些方面的不足与缺陷，像由于肿瘤、创伤或先天疾病导致的患者骨量不足以及无法直接有效地在颌骨上进行种植；此时，自体骨移植由于不存在免疫排斥反应且骨缺损修复能力较强，成为治疗骨缺损的最佳选择[1]；但由于颌骨有限的供骨量以及取骨会造成二次创伤从而极大限制了它在临床上的应用。对于颌骨大面积缺损的患者，临床迫切需要一种可批量生产但又具有良好力学及生物学性能的替代材料，以满足的骨缺损修复需要。

随着该领域的研究不断发展和创新，支架材料这一基本构架被研究学者提出，同时利用支架材料已经成功引导及参与机体细胞增殖、分化和新生骨迅速形成的过程[2]。实验研究发现，骨组织和新生血管的形成因生物支架表面形态的变化而受到影响，这主要是通过影响材料的微孔隙率、光滑度和支架的力学性能，进一步调控蛋白吸附及细胞生物学行为来实现的[3～5]；但材料形态与细胞生物学行为的关系目前研究尚不明确，其机制还需进一步探索。近些年来的研究表明细胞生物学行为，如：细胞粘附、铺展、迁移、增殖以及分化，不仅与周边微环境密切相关，也与材料表面的形态密切相关[6，7]；支架材料在临床研究进展中受到阻碍，与其生物相容性和稳定性的不理想密切相关。最近有一些学者通过在支架表面构建沟槽结构，发现细胞能够沿着沟槽方向进行取向性迁移及生长，这些实验证明：不通过外加的化学修饰就可对细胞生物学行为及其功能进行调控[8]。

1 材料与方法

1.1 材料 微渠(HAS-G)和非微渠结构(HAS)的多孔羟基磷灰石支架由西南交通大学材料先进技术教育部重点实验室制作及提供。健康比格犬4只，均为雄性，年龄为10～14个月，体重为9～10公斤，由四川省医学科学院·四川省人民医院动物中心提供。实验过程严格按照2006年科技技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 方法

1.2.1 材料制备及表征 采用糖球造孔剂及湿化处理技术在多孔羟基磷灰石支架的宏孔孔壁表面构建规则的沟槽结构，糖球模板在湿度为70%的条件下处理24 h后所制备的多孔羟基磷灰石支架，宏孔孔壁表面上沟槽的宽度为25～30 μm，此为HAS-G。未经过湿化处理制备的HAS宏孔孔壁表面十分平整，为非微渠结构的多孔羟基磷灰石支架。采用扫描电子显微镜(SEM)观察材料的孔结构及表面的微观形貌，密度法测量多孔羟基磷灰石支架的孔隙率。试样加工为Φ10 mm×8 mm的圆柱体，经高温高压灭菌后备用。

1.2.2 支架植入及取出 4只比格犬分为HAS-G和HAS两组各2只；采用3%戊巴比妥钠/生理盐水混合麻醉剂1 ml/kg经静脉注射麻醉，将犬只俯卧在手术台上，背腰部位约30 cm×20 cm区域进行褪毛、清洗和消毒处理。常规消毒与铺巾后，手术区沿背脊中线长轴切开皮肤皮下，在左右两侧背肌内各植入4个支架材料，各犬只共植入8个支架。缝合肌袋后用生理盐水冲洗，分层缝合皮下组织，碘伏消毒。术后3 d内每天肌肉注射青霉素160×104单位及碘伏棉签消毒伤口一周预防感染。植入后1、3个月时各处死2只动物取出所有支架材料，剔除周围肌肉组织进行组织学制样等检测，见图1。

图1 支架材料植入背肌过程

1.2.3 组织学检测 每组在术后1个月和3个月，分别处死一只比格犬，在各只比格犬背肌内随机取出3块样品，经固定、脱钙、石蜡包埋后，在长轴中心处平行于圆形截面做连续切片，经HE染色在光镜下观察两组的新生骨及血管形成情况。

1.2.4 力学检测 各组在其余支架材料中随机挑选3块(平行样本)。去除支架外层包裹的软组织，采用Instro5567 型材料万能力学实验机(美国英特斯朗)，进行抗压强度检测，负载强度为30 kN，抗压加载速度0.5 mm/min，载荷精度±0.25%；计算平均值。每组测量3个平行样品，材料均按管材进行计算。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件将所得数据均进行处理。抗压强度测试的数据通过配对t检验进行分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 材料表征 HAS-G及HAS，孔隙率为80%左右，平均孔径750～900 μm，大孔相互贯通，孔壁上有微孔，见图2。HAS-G的宏孔孔壁表面具有25～30 μm沟槽结构，而HAS宏孔孔壁表面平滑。

图2 羟基磷灰石支架的扫描电镜图片(SEM × 500) a：微渠支架；b：非微渠支架

2.2 组织形态学观察 材料植入1个月和3个月后均观察到骨诱导现象。植入1个月时，两种多孔羟基磷灰石支架内部可见结缔组织和血管长入，宏孔内形成薄的钙化骨基质沉积，其中可见少量骨细胞(图3a 和图4a)。随着材料植入时间的延长至3个月后，两种多孔羟基磷灰石支架宏孔内的新生血管和新骨组织也明显增加，组织学结果显示所有支架的宏孔内有明显的骨痂和新骨组织形成，且新骨组织多沿宏孔孔壁生长(图3)。在形成的新骨上有明显的骨陷窝存在，有大量的成骨细胞和多核破骨细胞。HE染色可见，在植入背肌3个月后，HAS-G较HAS形成的新生血管的数量及新骨形成量明显更高(图3b 和图4b)。

图3 HAS-G组织学图片(HE×100) a：1月；b：3月； NB：新生骨；S：多孔羟基磷灰石支架材料；红色箭头示新血管；黑色箭头示新生骨沉积

2.3 力学性能检测 植入材料进行抗压强度测试后，发现植入后材料的抗压强度增强较植入前的材料有明显增强，随着植入时间延长至3个月后，HAS-G和HAS的抗压强度均较一个月时有所增强，各组抗压强度测试结果见表1。HAS-G和HAS植入体内后，一个月和三个月时HAS-G的抗压强度均高于HAS，差异有统计学意义(P< 0.01)，且植入三个月后较植入一个月时支架材料的抗压强度也有所增强，差异有统计学意义(P< 0.05)。

图4 HAS组织学图片(HE×100) a：1月；b：3月； NB：新生骨；S：多孔羟基磷灰石支架材料；黑色箭头示新生骨沉积

表1 两组HA支架体内植入后不同时期抗压强度比较 (MPa)

a与未植入比较，P< 0.01

3 讨论

颌骨骨缺损不仅给患者的生活来带诸多不便，同时也对其精神造成极大的痛苦。近年来构建组织工程骨也是颌面骨缺损修复重建领域的一个研究热点，是指利用组织工程的原理在体外构建具有骨诱导性的人工骨替代材料，用于修复骨缺损或替代丧失功能的骨组织[9]；构建组织工程骨有三要素：种子细胞、生长因子和支架材料[10]，其中支架材料在骨缺损修复的过程中，不仅为细胞的粘附、增殖及细胞质基质的沉积提供支架结构，同时也为新生骨组织及血管长入提供生长空间[11]。在关于支架内特异结构方面的研究，有的学者着手于孔径尺寸与孔形态方面对骨组织再生影响的研究，指出理想的支架应当同时拥有宏观孔隙及微观孔隙相结合的多孔结构以促进细胞的粘附、新骨的形成及血管的生长[12]；有的学者则探讨孔隙率与贯通性对骨组织再生的影响，提出较高的孔隙率有利于细胞，血管及组织更多的生长，通过调节支架的孔隙率可以优化其生物学功能，并调控新骨组织在支架内的形成能力[13]；另一些学者研究材料表面微纳米结构对骨组织再生的影响，发现表面微纳米结构的改变会影响材料表面的粗糙度、微孔隙率及力学性能，从而影响蛋白吸附及细胞行为进而调控组织的形成[14，15]。本实验从材料表面的微纳米结构这一方面出发，展开实验。

近年来，很多研究资料表明在材料表面形成的沟槽结构可促使细胞沿沟槽取向性生长和迁移，调控细胞的生物学行为和功能时也无需添加额外的化学修饰[16]。Watari等[17]将表面光滑和表面有沟槽结构的硅基底与骨髓间充质干细胞共培养3天，发现RUNX2和BGLAP 的表达在具有沟槽结构的硅基底中有明显增加，且BMP的表达也有显著提高，因此认为沟槽结构可增强成骨诱导作用。Nadeem等[18]在氧化铝陶瓷表面制备了宽度分别为10 μm和50 μm的沟槽结构，并与细胞共培养21天后。发现在宽度为50 μm的沟槽上有更多的类骨基质形成，得出50 μm的沟槽结构更有利于提高陶瓷材料植入体内骨整合性的结论。但这类研究多局限于在支架材料表面构建沟槽结构，而将此种结构整合于多孔支架宏孔的表面，进一步调控新生骨及血管的形成仍就是一个挑战。本实验从支架内构建微纳米结构-微渠结构出发，探讨微渠结构对羟基磷灰石支架体内骨诱导性的影响。

本实验以多孔羟基磷灰石为支架材料，采用糖球造孔剂及湿化处理技术，将沟槽结构整合到三维多孔支架的表面；通过在比格犬背肌中实施体内实验，采用组织学观察、影像学检测及生物力学检测的方法对骨移植材料有效骨再生的情况进行评价[19]。在本实验中，各个时间点的所有样本均观察到成骨现象，支架植入1个月后即可在支架内每个孔隙中看到一圈成骨细胞和薄层的骨基质，孔壁周围有骨沉积。随着植入时间的延长，多孔羟基磷灰石支架孔壁上的骨层不断增厚，孔壁内新生骨、新生血管逐渐增多，但微渠组支架内的新生骨量及血管数量仍多于同期的非微渠组。经过改建的体内组织工程骨移植物的力学性能较单纯多孔羟基磷灰石支架材料有明显提高，植入后的材料脆性改善，韧性增强，在承受应力时不像易发生脆裂；三个月后非微渠组平均抗压强度为1.658 MPa，而微渠组则增加至3.758 MPa，可以看出微渠组的力学性能的提升优于非微渠组。从组织形态学观察、抗压强度测试及骨密度值测定等数据的统计学分析，均可看出微渠和和非微渠结构的多孔羟基支架诱导新骨形成的差别。

综上所述，微渠结构能够提高多孔羟基磷灰石支架在体内成骨效果，对今后的植入材料内孔隙表面微型结构的研究具有一定指导意义，但其相关的生物学机制仍需进一步探讨，临床上应用的很多问题也亟待解决。

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Osteogenesis of micro-grooved patterns of porous hydroxyapatite scaffolds in non-osseous tissue

LVXin-rong1，WENYong-mei1，WUJia1，MUYan-dong1，2
(1.SouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000，Sichuan，China；2.Oralimplant，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

MUYan-dong

Objective The study is aimed to evaluate the influence of the micro-grooved patterns of porous hydroxyapatite (HA) scaffolds on osteogenesis by means of implanting HA in non-osseous tissue.Methods The muscle tissue on the back of 4 Beagle dogs were taken as test area and divided into two groups (HAS-G and HAS)，2 dogs in each group.They were implanted with HAS-G and HAS，respectively.The specimens were respectively harvested at 1 and 3 months post operation for histological studies and mechanical measures.The osseous tissue formation at different times was compared between the two groups.The new bone grafts with micro-grooved patterns were evaluated.Results All kinds of scaffolds could construct new bone in muscle.However，blood vessels and number of new bone formed at each time in the HAS-G group was obvious more than those in the HAS group.The HAS-G was also better than HAS in compressive strength tests.Conclusion Compared to HAS，HAS-G show the obvious advantages of mechanics and biology.It could have brighter prospect to clinical application.

Micro-groove； Porous hydroxyapatite； Scaffold； Osteoinductive

四川省科技厅科研基金资助项目(编号：2016TD0008)

牟雁东

R783.1

A

1672-6170(2017)03-0028-04

2017-02-27；

2017-03-21)