丝胶对2型糖尿病大鼠视网膜NF-κB表达的影响*

杨 帆，董志军△，董微丽△，张铁民，陈志宏，于宏飞

（1.承德医学院附属医院眼科，河北承德 067000；2.承德医学院人体解剖学教研室）

基础医学

丝胶对2型糖尿病大鼠视网膜NF-κB表达的影响*

杨 帆1，董志军1△，董微丽1△，张铁民1，陈志宏2，于宏飞1

（1.承德医学院附属医院眼科，河北承德 067000；2.承德医学院人体解剖学教研室）

目的:探讨丝胶对2型糖尿病大鼠视网膜核因子-κB(NF-κB)表达的影响。方法：48只健康雄性SD大鼠随机分为4组：正常对照组、糖尿病模型组、丝胶治疗组和导升明组，每组12只。除正常对照组外，其余3组大鼠均采用高糖高脂饮食诱导联合小剂量链脲佐菌素(25mg/kg/d，3d)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型。待模型建成后，丝胶治疗组大鼠给予丝胶(2.4g/kg/d，35d)灌胃治疗，导升明组大鼠给予导升明(200mg/kg/d，35d)灌胃。Western blot法检测视网膜NF-κB蛋白的表达，RT-PCR法检测视网膜NF-κB mRNA的表达。结果：与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠NF-κB蛋白和mRNA的表达明显升高(P＜0.05)；与糖尿病模型组比较，丝胶治疗组和导升明组大鼠NF-κB蛋白和mRNA的表达显著降低(P＞0.05)。结论：丝胶可通过下调NF-κB表达，发挥对糖尿病视网膜损伤的保护作用。

丝胶；糖尿病视网膜病变；NF-κB

随着生活水平的提高，糖尿病患病人数逐年增加，其慢性微血管并发症之一的糖尿病视网膜病变（DR）亦越来越受到人们的关注[1-2]。DR发生的确切原因不明，近来有人提出它是一种慢性炎症性疾病[3]。 核因子-κB(NF-κB)是一种普遍存在于各类细胞中的核转录因子，在炎症反应、氧化应激及细胞增殖、分化和凋亡等生理病理过程中发挥着重要作用[4-5]。丝胶是一种蚕茧水提物，已有研究发现丝胶能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖，以及保护糖尿病时肾脏和中枢神经系统损伤[6]。但关于丝胶对DR是否有保护作用的研究尚少。本研究拟通过观察丝胶对DR大鼠视网膜NF-κB表达的变化，探究丝胶对DR微血管病变的保护作用，为丝胶治疗DR提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物与主要试剂：蚕茧，承德医学院蚕业研究所；导升明，奥地利依比威药品有限公司；链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；小鼠抗NF-κB单克隆抗体，英国Abcam公司；小鼠抗β-actin单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；即用型HRP标记的山羊抗小鼠IgG，美国KPL公司；NF-κB引物，美国Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒，日本Takara公司。

1.1.2 实验对象：SPF级雄性SD大鼠，体重200-250g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK (京) 2012-0001。

1.2 方法

1.2.1 实验对象处理：48只SD大鼠随机平分为4组。正常对照组大鼠给予普通饲料喂养；其余3组大鼠给予高糖高脂饲料喂养，并给予STZ(25mg/kg/d，3d)腹腔注射，以空腹血糖≥11.1mmol/L作为2型糖尿病大鼠成模标准。模型建成后，丝胶治疗组大鼠给予丝胶(2.4g/kg/d，35d)灌胃，导升明组大鼠给予导升明(200mg/kg/d，35d)灌胃，其余两组大鼠给予相同剂量生理盐水灌胃相同时间。

1.2.2 标本制备：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后迅速摘除双侧眼球，分离视网膜组织，液氮中速冻后转入-80℃冰箱中保存，用于NF-κB蛋白和mRNA的检测。

1.2.3 Western blot法检测视网膜NF-κB蛋白表达： 提取视网膜组织中总蛋白，BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。各组上样量为50μg，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉TBST封闭2h，分别加入一抗NF-κB(1∶500)和β-actin(1∶1000)，4℃过夜，二抗室温摇床孵育1h，ECL超敏发光液显影。扫描胶片，应用凝胶分析软件对条带光密度值进行分析，将β-actin作为内参，计算NF-κB条带与β-actin条带的灰度比值。

1.2.4 RT-PCR法检测视网膜NF-κB mRNA的表达：按TaKaRa总RNA抽提说明书提取大鼠视网膜组织中的总RNA，并反转录为cDNA。PCR反应条件：94℃预变性，2min；94℃变性，30s；56-60℃退火，30s；72℃延伸，45s-1min，第2步起循环。PCR引物序列及扩增条件见表1。取10μl扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳(120V，40min)，图像摄取采用ZF型紫外透射反射分析仪，应用凝胶分析软件进行定量分析，将β-actin作为内参，计算NF-κB条带与β-actin条带的灰度比值。

表1 PCR引物序列及扩增条件

1.3 统计分析 采用SPSS 19.0统计学软件处理数据，实验数据用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜NF-κB蛋白的表达 Western blot结果显示：NF-κB蛋白条带在蛋白Marker的65KD处可见，β-actin蛋白条带在蛋白Marker的43KD处可见。视网膜NF-κB蛋白的表达，在糖尿病模型组大鼠明显高于正常对照组大鼠(P＜0.05)；在丝胶治疗组和导升明组大鼠明显低于糖尿病模型组大鼠(P＜0.05)，且二组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

2.2 各组大鼠视网膜NF-κB mRNA的表达 RT-PCR结果显示：NF-κB mRNA条带在DNA Marker的380bp水平处可见，β-actin mRNA条带在DNA Marker的452bp水平处可见。视网膜NF-κB mRNA的表达，在糖尿病模型组大鼠明显高于正常对照组大鼠(P＜0.05)；在丝胶治疗组和导升明组大鼠明显低于糖尿病模型组大鼠(P＜0.05)，且二组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2：

表2 各组大鼠视网膜NF-κ B蛋白和mRNA的表达（±s ）

表2 各组大鼠视网膜NF-κ B蛋白和mRNA的表达（±s ）

与糖尿病模型组比较：*P＜0.05；与导升明组比较：#P＞0.05

组别 n NF-κB蛋白 NF-κB mRNA正常对照组 12 0.6018±0.0261* 0.5252±0.0173*糖尿病模型组 12 1.5317±0.0172 1.4197±0.0135丝胶治疗组 12 0.7069±0.1755*# 0.7081±0.0287*#导升明组 12 0.6946±0.0125* 0.6989±0.0158*

3 讨论

NF-κB是一种细胞内重要的核转录因子。在静息状态下，NF-κB在细胞浆中与其抑制单位κB（IκB）结合形成无活性的化合物，受到缺氧、高糖及炎性因子等刺激后，NF-κB从细胞浆转移入细胞核内，恢复其转录活性，广泛参与体内的炎症反应[7]。同时，被激活的NF-κB能刺激多种炎症因子的表达，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血小板源性生长因子(PDGF)、细胞间黏附分子(ICAM-1)、白细胞介素(IL)等，从而加重炎症反应[8]。本研究发现，NF-κB蛋白及mRNA在糖尿病模型组处于高表达状态。糖尿病时长期的高血糖可导致全身代谢出现异常，视网膜毛细血管结构和功能遭到破坏，从而引起视网膜血流动力学的改变，当视网膜长时间处于缺血、缺氧状态时，会引起视网膜局部炎症反应增强，诱导NF-κB表达异常升高，进而增加多种炎症因子的基因转录，从而参与糖尿病及其微血管病变的发生发展。由此可见，NF-κB可能是DR的中心调节因子。

蚕茧是蚕蛾的茧壳，《本草纲目》中记载：蚕茧，味甘、性温，无毒，煮汤治消渴。糖尿病乃中医的“消渴症”，民间早就有用蚕茧泡水降低血糖的方法。以前人们对蚕丝的利用主要集中在丝素上，而丝胶则作为废料被丢弃。近年来，许多研究者们开展了对丝胶的研究，并发现其具有抑制炎症反应、抑制氧化应激、促进细胞增殖等功效[9-11]。本研究结果显示：丝胶治疗组大鼠视网膜NF-κB蛋白及mRNA的表达较糖尿病模型组明显降低，说明丝胶可通过下调NF-κB的表达，减轻DR的炎症反应，遏制糖尿病视网膜损伤的进展，但丝胶调控NF-κB表达的机制尚需进一步研究。由于丝胶是天然的蛋白质，具有毒副作用小的优点，因此可能为DR提供新的治疗方法。

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EFFECTS OF SERICIN ON NF-ΚB EXPRESSION IN RETINA OF TYPE 2 DIABETIC RATS

YANG Fan, DONG Zhi-jun, DONG Wei-li, et al
(Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate the effects of sericin on expression of NF-κB in retina of type 2 diabetic rats. Methods: 48 male SD rats were randomly divided into 4 groups(n=12): nomal control group, diabetes model group, sericin treatment group and doxium treatment group. Except rats in nomal control group, the type 2 diabetes model rats were made by high sugar and high fat diet combined with small dose of streptozotocin (25mg/kg/d, 3d) by continuous intraperitoneal injection in the other 3 groups. After the diabetes animal model was successfully established, the rats in sericin treatment group were lavaged with sericin for 35d (2.4g/kg/d), the rats in doxium treatment group were lavaged with doxium for 35d (200mg/kg/d). Western blot and RT-PCR were used to detect the expression of NF-κB protein and mRNA in retina respectively. Results: Compared with nomal control group, the NF-κB expression in retina of rats in diabetes model group increased obviously (P＜0.05). Compared with diabetes model group, the NF-κB expression in retina of rats in sericin treatment group and doxium treatment group decreased obviously (P＞0.05). Conclusions: Sericin has protective effects on diabetic retinophathy by downregulating NF-κB expression in retina.

Sericin; Diabetic retinopathy; NF-κB

R587.1

A

1004-6879（2017）03-0181-03

2016-09-01）

*国家自然科学基金项目（81441133），河北省自然科学基金项目（H2012406018）

△通讯作者