牡丹DNA甲基结合域蛋白基因PsMBD5的克隆和表达特性分析

司福会，张玉喜，刘春英，盖伟玲，战新梅，盖树鹏

(1.青岛农业大学 生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东 青岛 266109；2.青岛农业大学 农学与植保学院，山东 青岛 266109)

牡丹DNA甲基结合域蛋白基因PsMBD5的克隆和表达特性分析

司福会1，张玉喜1，刘春英1，盖伟玲2，战新梅1，盖树鹏1

(1.青岛农业大学 生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东 青岛 266109；2.青岛农业大学 农学与植保学院，山东 青岛 266109)

前期通过转录组结合表达谱分析发现一类MBD片段在低温解除牡丹花芽内休眠中的差异表达，为了进一步研究MBD基因特征及其在牡丹休眠解除中的作用，利用RACE扩增获得1 204 bpPsMBD5全长cDNA，其中编码框1 056 bp，推测编码351个氨基酸。生物信息学分析结果显示，PsMBD5蛋白分子量约为38.127 4 kDa，等电点为5.14，不稳定系数为44.27，推测该蛋白为不稳定蛋白。同源性分析表明，牡丹PsMBD5与梅PmMBD5的同源性最高，为38.1%，与亚麻荠CsMBD5的同源性最低，为25.8%，与13种拟南芥MBD蛋白同源性最高的是AtMBD5。实时荧光定量PCR分析表明，PsMBD5基因在牡丹不同组织中均有表达，在初花期牡丹的根中转录水平最高，在花瓣、心皮和萼片中次之，在雄蕊中最低；PsMBD5基因在牡丹花芽中受低温诱导，且转录水平在低温处理14 d时达到最大值，之后维持较高的转录水平。研究结果为进一步解析PsMBD5基因对牡丹花芽的休眠解除的调控机制奠定基础。

PsMBD；RACE；生物信息学分析；表达特性

DNA甲基化现象是DNA主要的一种表观遗传修饰，在植物的生长发育、花芽分化、非生物胁迫、基因组防御、基因表达调控等方面发挥着重要作用[1]。DNA甲基结合域(Methyl-binding domain，MBD)蛋白是一类转录因子，与甲基化DNA结合有关，在DNA甲基化依赖的基因调控过程中起作用[2]。近年来，表观遗传中的DNA甲基化和MBD研究已成热点。拟南芥中已经鉴定出13个具有MBD结构域的蛋白，其中MBD5、MBD6和MBD7能够特异性结合不同数量的CpG核苷酸的甲基化序列，而AtMBD5蛋白能够特异性结合甲基化的CG和CHH序列，不能够结合甲基化的CHG序列[3-4]。多个MBD基因参与生长发育的调控[5-6]，mbd9突变体植株的发育异常，开花时间提前[7]；超表达SlMBD5导致番茄果实色素合成增加，植株矮化[8]；AtMBD7参与DNA的去甲基化过程，降低植株甲基化水平[9-10]，小麦中TaMBD6基因受春化作用诱导，促进淀粉积累量增加[11]。关于牡丹MBD转录因子的研究目前尚未见报道。

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)为毛茛科、芍药属植物，素有“花中之王”的美誉。解除花芽休眠是牡丹顺利开花的前提[12]。牡丹生物学课题组前期通过转录组和表达谱分析，发现一个可能的MBD片段在低温解除休眠中差异表达[13-14]，另外还发现低温解除休眠进程中DNA甲基化水平是下降的[15]，表明表观遗传修饰在休眠解除中发挥了作用。目前仍不清楚该基因是否参与了休眠解除的调控。本研究利用RACE扩增得到PsMBD5基因的完整cDNA序列，并进行生物信息学分析。实时定量PCR分析了PsMBD5基因组织表达特性和休眠解除中的表达模式，研究结果为进一步解析PsMBD5基因的功能及牡丹花芽内休眠解除的分子机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为生长健壮的四年生牡丹品种鲁荷红(PaeoniasuffruticosaLuhehong)，购自菏泽牡丹研究所。2015年11月10日移入4 ℃恒温的冷库中进行低温处理，分别在0(对照)，7，14，21，28 d处理后取饱满一致的芽投入液氮速冻，-80 ℃保存备用。取初花期牡丹的营养器官(根、茎和叶)和花器官(萼片、苞片、花瓣、雄蕊和心皮)，立即投入液氮中速冻后，-80 ℃保存。3个重复，每重复3个花芽或组织。

1.2 总RNA提取与cDNA合成

采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa，大连)提取总RNA，-80 ℃保存。cDNA的合成按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒(TaKaRa，大连)说明书进行。RACE-ready-cDNA第一链合成按照SMARTer®RACE 5′/3′ Kit试剂盒(Clontech)步骤进行。

1.3 RACE扩增和实时定量PCR

根据已知序列设计基因特异性引物PsMBD5′和PsMBD3′(表1)，分别进行5′和3′RACE扩增。RACE扩增反应条件：94 ℃ 30 s、72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s、72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 3 min，25个循环。

将反转录得到的cDNA第一链反应液用EASY dilution(TaKaRa，大连)稀释3倍后作为实时定量PCR模板，其反应体系(20 μL)包含2×SYBR Premix Dimer EraserTM10 μL(TaKaRa，大连)，正向引物和反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free dH2O 6.8 μL，每个样品3个重复。反应在安捷伦实时荧光定量PCR仪(M×3000P)上进行。反应条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环。Actin为内参(引物见表1)[16]，数据分析采用2-ΔΔCT法[17]。

表1 相关引物信息

1.4 生物信息学分析

测序结果用DNAMAN 6.0软件进行序列分析、拼接，将拼接序列翻译的蛋白质序列利用Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行蛋白质Blast比对。蛋白质的分子质量、等电点的预测、信号肽的分析以及核定位信号的预测所运用的方法参考石红梅等[18]。利用ClustalW分析了PsMBD5与其他MBD蛋白的同源性。系统发生树利用MEGA 4软件中的邻接法(Neighbor-joining)构建，置信度检验设置为Bootstrap=1 000。

2 结果与分析

2.1 PsMBD5基因的全长cDNA及推测编码的氨基酸

利用基因特异性引物PsMBD5′和PsMBD3′进行RACE扩增，如图1所示，5′ RACE PCR产物为876 bp，3′RACE PCR产物为330 bp。测序后利用DNAMAN 6.0软件进行序列拼接(图2)，获得1 204 bpPsMBD5基因的全长cDNA(GenBank accession number：KX517491)，完整的开放阅读框(Open reading frame，ORF)1 056 bp，3′非编码区(Untranslated region，UTR)146 bp。利用NCBI在线Blast发现其氨基酸序列中217-271氨基酸(E-value为4.21e-11)序列为MBD保守结构域。

M.DL2000 分子量Marker；5′.5′ RACE；3′.3′ RACE。M.DL2000 molecular Marker；5′.5′ RACE；3′.3′ RACE.

2.2 PsMBD5基因生物信息学分析

PsMBD5基因的完整编码区推测编码351个氨基酸，其分子式为C1682H2603N463O535S8，分子量为38.127 4 kDa，理论等电点pI为5.14；不稳定指数为44.27(40以下为稳定蛋白)，推测该蛋白为不稳定蛋白；丝氨酸的含量最高为10.5%，其次是脯氨酸占9.4%，甘氨酸占8.8%，缬氨酸占8.5%；总平均疏水指数为-0.566，表明其为亲水性蛋白。信号肽预测结果表明，其不具有信号肽序列，表明其不是分泌性蛋白。推测在蛋白的第191-201位(RRGRKRKSEKM)和第286-295位(GGRKRKKSVP)存在核定位信号。

2.3 PsMBD5蛋白序列的同源性分析

利用ClustalW软件将PsMBD5与其他已知植物的MBD蛋白进行同源比对，结果表明，PsMBD5与其他已知植物MBD蛋白的相似性为25.8%～38.1%，其中与梅的PmMBD5蛋白相似性最高，为38.1%，与亚麻荠CsMBD5蛋白同源性最低，为25.8%。与13种拟南芥MBD蛋白同源性最高的是AtMBD5，相似性为32.97%。利用MEGA 4软件构建系统进化树(图3)，PsMBD5与多种生物的MBD5聚在一起，据此命名了该基因。

用加粗斜体表示起始密码子和终止密码子；polyA尾用双下划线表示；PsMBD保守区用波浪线表示；核定位信号NLS以单下划线表示。

Bold italic.Initiation codon and terminate codon；Double underline.polyA tail；Wavy line.Conservative regions；Single underline.The nuclear localization signal NLS.

图2 牡丹PsMBD5基因拼接得到的cDNA全长序列及其编码的氨基酸序列

Fig.2 Nucleotide sequence of tree peonyPsMBD5 cDNA sequence and encoding amino acid sequence

梅.PmMBD5；苹果.MdMBD5；枣.ZjMBD5；葡萄.VvMBD5；牡丹.PsMBD5；可可树.TcMBD5；拟南芥.AtMBD；亚麻荠.CsMBD5；胡杨.PeMBD5；麻风树.JcMBD5。

2.4 PsMBD5基因的表达模式

利用实时定量PCR分析PsMBD5基因在牡丹初花期各组织(根、茎、叶片、萼片、苞片、花瓣、雄蕊和心皮)的表达特性(图4)，结果显示，PsMBD5基因在根中的表达量最高，在花瓣、心皮和萼片中表达量较高，在雄蕊中最低。

利用实时定量PCR分析了PsMBD5基因在不同人工低温处理时间(0，7，14，21，28 d)牡丹花芽的表达模式(图5)。结果表明，低温处理条件下，PsMBD5基因的表达水平均高于对照，可见该基因受低温诱导。低温处理14 d时达最大值，此时花芽休眠接近解除状态，移入温室后有较高萌发率[8，12]；之后表达水平迅速降低。这一结果暗示着PsMBD5基因可能参与牡丹内休眠解除的调控。

图4 牡丹PsMBD5基因在初花期不同组织中的表达

图5 牡丹PsMBD5在牡丹花芽休眠进程中的表达

3 讨论

甲基结合蛋白(MBD)是与甲基化DNA结合的反式作用因子，在植物生长发育过程中起调控作用。通过牡丹定制芯片分析发现一可能的MBD片段在低温诱导的休眠解除中差异表达[12]。本研究扩增得到了其全长cDNA，含保守的MBD结构域，进一步根据生物信息学分析结果将其命名为PSMBD5基因。其推测蛋白的第191-201位(RRGRKRKSEKM)和第286-295位(GGRKRKKSVP)存在核定位信号，可能与其在细胞核的执行功能有关，与报道的核定位结果一致[4，8，19]。

据报道，MBD基因的表达具有组织偏好性，AtMBD11在花芽、叶、根、种子、茎中都有较高水平的表达[7]，玉米MBD114在根尖和幼苗中表达，MBD120在叶中表达[20]，MBD101在根尖、叶片和小穗中表达[21]。本研究对PsMBD基因的组织表达特异性分析表明，在牡丹初花期的幼根中表达量最高，其次为花瓣、心皮和萼片中，与AtMBD5的表达相似[4]，推测牡丹PsMBD5基因在根的生长发育和花器官的发育中起到重要的作用。

最近的研究发现，MBD5不仅参与染色体重塑，还在细胞分裂中发挥了重要作用。Yano等[22]推测MBD5可能通过结合甲基化的DNA序列，招募RAN3蛋白，促进染色体的移动而促进细胞分裂。番茄中超表达SlMBD5基因导致未成熟番茄果实色素含量增加，植株矮化和果实变小[8]。牡丹PsMBD5基因的表达量在低温处理14 d迅速达到最大值(表达上升了约3 500倍)，此时是休眠解除的临界期，花芽内分裂细胞数目增多。推测低温通过某种方式激活了PsMBD5基因的表达，进而促进了细胞分裂，导致休眠的解除。因而，PsMBD5基因可能参与了牡丹内休眠的调控，深入研究PsMBD5基因与低温解除休眠中细胞分裂的关系，对阐明其调控休眠解除机制具有重要意义。

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Cloning and Expression Pattern of DNA Methyl-binding Domain GenePsMBD5 in Tree Peony

SI Fuhui1，ZHANG Yuxi1，LIU Chunying1，GAI Weiling2，ZHAN Xinmei1，GAI Shupeng1

(1.College of Life Sciences，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province，Qingdao 266109，China；2.College of Agronomy and Plant Protection，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

The previous results of the transcriptome and expression profiling analysis in tree peony found that aMBD-like fragment was differentially expressed during low temperature induced dormancy release.To investigate the characteristic and putative function ofMBDduring tree peony bud dormancy release，total 1 204 bp full length cDNA ofPsMBD5 was obtained by RACE amplification.The coding fame of 1 056 bp encoded 351 amino acids.The result of bioinformatics analysis showed that the molecular weight of PsMBD5 was 38.127 4 kDa，isoelectric point was 5.14，which indicated that PsMBD5 was an unstable hydrophilic.The result of homology analysis indicated that the similarity between the PsMBD5 and PmMBD5 was the highest with 38.1% identity，and CsMBD5 was the lowest with 25.8%.When compared with 13 kinds of AtMBD，the identity between the PsMBD5 and AtMBD5 was the highest.The expression patterns were analyzed by Real-time quantitative PCR，and the results showed that the transcript level ofPsMBD5 at the early stage of flowering in root was the highest，followed by in petals，carpel and sepals，and in stamen was the lowest.During the whole process of chilling fulfillment，PsMBD5 was highly induced by low temperature.The transcript level ofPsMBD5 was the highest after 14 d chilling fulfillment，and maintained a high level of transcription after that.These results would provide theoretical basis to validate the regulation mechanism ofPsMBD5 during the peony bud dormancy release.

PsMBD；RACE；Bioinformatics analysis；Expression pattern

2017-01-06

国家自然基金面上项目(31471908；31372104)

司福会(1990-)，女，山东菏泽人，在读硕士，主要从事牡丹分子生物学研究。

盖树鹏(1974-)，男，山东莱阳人，教授，博士，主要从事牡丹分子生物学研究。

Q78;S685.03

A

1000-7091(2017)02-0066-05

10.7668/hbnxb.2017.02.011