miRNA-34a和miRNA-29b在非小细胞肺癌中的表达及意义

赵淑灿 郑定容

·论著·

miRNA-34a和miRNA-29b在非小细胞肺癌中的表达及意义

赵淑灿 郑定容

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者肺癌组织标本中miRNA-34a和miRNA-29b基因的表达与临床特征及化疗疗效的相关性。方法 将已确诊的80例NSCLC患者肿瘤肺组织作为试验组(并按病理类型及TNM分期分组)，同期随机选择肺部为良性疾病肺组织100例作为对照组，通过实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)法检测 miRNA-34a和miRNA-29b基因表达水平，并回顾性分析miRNA-34a和miRNA-29b基因表达与化疗疗效情况。结果 miRNA-34a在试验组的组织表达水平高于对照组(P<0.05)；miRNA-29b在试验组的组织表达水平低于对照组(P<0.05)；miRNA-34a在腺癌组与鳞癌组均明显高于其他型肺癌组(P<0.05)，在腺癌组组中的表达高于鳞癌组(P<0.05)，miRNA-29b在腺癌组与鳞癌组均明显低于其他型肺癌组，在腺癌组中的表达低于鳞癌组(P<0.05)，miRNA-34a和miRNA-29b在肺癌组织分级、TNM分期及淋巴结转移呈密切相关性(P<0.05)。miRNA-34a高表达组患者化疗有效率显著低于低表达组患者(P<0.05)；miRNA-29b低表达组患者化疗有效率显著低于高表达组患者(P<0.05)。NSCLC组织中miRNA-34a的表达和 miRNA-29b的表达之间呈负相关(r=-0.79，P<0.01)。结论 miRNA-34a的基因表达在NSCLC中高表达，miRNA-29b的基因表达在NSCLC中低表达，它们表达水平有助于临床分期组、织学分级和淋巴结转移的判断，并且miRNA-34a低表达或者miRNA-29b高表达的患者化疗有效率高，是化疗受益的指标之一。

非小细胞肺癌；mRNAs；疗效；miRNA-34a；miRNA-29b；临床意义

肺癌是严重威胁人类健康与生命的非常常见的恶性肿瘤之一，随着大气污染的加重，其发病率和病死率均是最高，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占的肺癌患者的85%，发病较隐匿，并且50%的NSCLC患者确诊时即为晚期肺癌患者[1],存在不同程度转移情况,从而丧失根治手术的机会，晚期NSCLC化疗效果多不满意[2]，这使得NSCLC的早期诊断显得尤为重要。研究表明，肿瘤患者癌组织中可检测到miRNAs表达异常，这让癌组织中miRNAs成为一种非侵入性的肿瘤标志物提供了方向[3]。我们通过检测并比较NSCLC患者肿瘤肺组织以及健康者肺组织中miRNA-34a和miRNA-29b的表达情况，并回顾性分析miRNA-34a和miRNA-29b基因表达与化疗疗效情况，以期为NSCLC的诊断及治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取汕头市中心医院于2014年12月至2015年7月确诊的80例NSCLC患者为研究对象，所有病例均符合《原发性肺癌诊疗规范(2011年版)》中关于“NSCLC的诊断标准”[4]；所有入选病例有完整的临床病例资料，既往无其他恶性肿瘤病史，排除有化疗禁忌证的患者，排除合并终末期肝病或肾病及其他部位恶性肿瘤患者，入院之前未接受过化疗和放疗；其中男42例,女38例；年龄26～80岁，平均年龄(50.7±12.6)岁。80例NSCLC患者肿瘤肺组织为试验组，其中肺鳞癌30例为鳞癌组，肺腺癌35例为腺癌组，其他型肺癌15例为其他型肺癌组，淋巴结转移42例为转移组，无淋巴结转移者38例为无转移组，TNM分期按照国际肺癌研究会(IASLC)公布的标准[5]，TNM Ⅰ期20例为Ⅰ组、TNM Ⅱ期22例为Ⅱ组，TNM Ⅲ期19为Ⅲ组、TNM Ⅳ期19例为Ⅳ期，同期随机选择肺部为良性疾病肺组织100例作为对照组，患者家属均知情，依从性良好并签署化疗知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 治疗:试验组患者化疗30 min前均给予甲氧氯普胺与昂丹司琼进行止吐治疗,化疗治疗在第1天和第8天均给予吉西他滨(ELI LILLY AND COMPANY)1 000 mg/m2静脉滴注,顺铂(齐鲁制药有限公司)75 mg/m2，给予吉西他滨静滴后再给予顺铂滴注，分4～5 d静脉滴注。21～28 d为1个疗程，治疗2个疗程后评价疗效；并按照世界卫生组织规定的评价标准评估患者的治疗效果[6]。

1.2.2 试剂及仪器:Taq酶、dNTP和2×缓冲液购自广州康遂生物科技有限公司；QIAamp DNA minikit DNA提取试剂盒购自北京中天经纬科技有限公司；总RNA提取试剂盒(TRIzol法)购自南京生兴生物技术有限公司；实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)仪器采用上海宏石医疗科技有限公司SLAN-96P实时荧光PCR分析仪，严格按照说明书进行操作。

1.2.3 PCR引物序列:参照Tsuyoshi等[7]方法设计正反及探针义链，内参基因为β-actin均由FAM标记，由广州中山大学达安基因有限公司合成，miRNA-34a引物序列，miRNA-29b引物序列。见图1、2，表1。

图1 miRNA-34a引物序列

图2 miRNA-29b引物序列

引物名称基因序列产物长度(bp)miRNA⁃34a 正义链P1：5’⁃TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTTGTGAGTATTAGCTAAGGAAGCAATCAGCAAGTATACTGCCCT⁃3’141 反义链P2：5’⁃ACCGTCACAGAATCGACCAACAACACTCATAATCGATTCCTTCGTTAGTCGTTCATATGACGGGA⁃3’miRNA⁃29b 正义链P1：5’⁃CGACCAAAGTATACCACCAAATCTAAATTTATCACTAACAGATCGTGGTAAACTTTAGTCACAA⁃3’112 反义链P2：5’⁃GCTGGTTTCATATGGTGGTTTAGATTTAAATAGTGATTGTCTAGCACCATTTGAAATCAGTGTT⁃3＇β⁃actin 正义链P1：5’⁃ACCATGGATGATGATATCGCC⁃3’436 反义链P2：5’⁃GCCTTGCACATGCCGG⁃3’

1.3 RNA抽提 用胰酶消化液(由北京百奥莱博科技有限公司提供)消化各组份研究对象组织并收集细胞，吸取5×106细胞使用磷酸缓冲盐溶液(PBS，南京森贝伽生物公司提供)清洗1次，加入1 ml TRIzol，静置后加入 200 ml氯仿，混匀，离心。取上清液加入500 μl 预冷的异丙醇(由济南德厚化工有限公司提供)沉淀RNA，再用预冷的75%乙醇(由上海励致化工有限公司提供)洗2次，自然干燥后加入50 μl焦碳酸二乙酯(DEPC，由临沂市利兴化工有限公司提供)水，用SMA2000Thermo超微量分光光度计(由北京中科科方技术开发有限公司提供)定量。

1.4 PCR检测 反应体系：2×缓冲液10.0 μl，10.0 μmol/L的引物P1 1.0 μl，10.0 μmol/L引物P2 1.0 μl，模板DNA 1.0 μl，ddH2O7.0 μl。PCR反应条件及循环：93℃变性2 min，95℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，75℃延伸5min，基因分析采用上海宏石医疗科技有限公司SLAN-96P实时荧光PCR分析仪自带的基因分析应用软件及Gen Bank对比分析基因序列同源性，严格按照说明书进行操作及判定结果，结果表达量采用2-ΔΔCT表示[8]，再进行各组肺组织中miRNA-34a和miRNA-29b的基因表达水平的比较。

2 结果

2.1 2组患者的组织miRNA-34a和miRNA-29b表达比较 miRNA-34a在试验组的组织表达水平高于对照组(P<0.05)；miRNA-29b在试验组的组织表达水平低于对照组(P<0.05)。见表2。

组别miRNA⁃29bmiRNA⁃34a试验组(n=80)0．86±0．246．68±2．63对照组(n=100)3．61±0．831．23±1．64t值25．7634．87P值<0．05<0．05

2.2 不同类型癌组织miRNA-34a和miRNA-29b表达比较 miRNA-34a在腺癌组与鳞癌组均有明显高于其他型肺癌组(P<0.05)，在腺癌组中的表达高于鳞癌组(P<0.05)，miRNA-29b在腺癌组与鳞癌组均有显低于其他型肺癌组(P<0.05)，在腺癌组组中的表达低于鳞癌组(P<0.05)，miRNA-34a和miRNA-29b在肺癌组织分级、TNM分期及淋巴结转移呈密切相关性(P<0.05)。见表3～5。

组别miRNA⁃29bmiRNA⁃34a鳞癌组(n=30) 2．16±0．538．31±2．82腺癌组(n=35) 3．29±0．75∗6．27±1．83∗其他型肺癌(n=15)4．71±1．32∗#4．22±1．31∗#F值26．7434．84P值<0．05<0．05

注：与鳞癌组比较，*P<0.05；与腺癌组比较，#P<0.05

2.3 miRNA-34a和miRNA-29b表达与化疗有效率比较 miRNA-34a高表达组患者化疗有效率显著低于低表达组患者(P<0.05)；miRNA-29b低表达组患者化疗有效率显著低于高表达组患者(P<0.05)。见表6。

组别miRNA⁃29bmiRNA⁃34aⅠ组(n=20)4．72±1．424．24±1．30Ⅱ组(n=22)3．49±1．21∗6．54±1．82∗Ⅲ组(n=19)3．56±0．72∗#7．14±2．31∗#Ⅳ组(n=19)2．74±0．42∗#△8．93±2．86∗#△F值26．9642．54P值<0．05<0．05

注：与Ⅰ组比较，*P<0.05；与Ⅱ组比较，#P<0.05;与Ⅲ组比较，△P<0.05

组别miRNA⁃29bmiRNA⁃34a转移组(n=42) 2．91±0．637．51±3．31无转移组(n=38)4．28±1．635．80±1．56t值29．6218．84P值<0．05<0．05

表6 miRNA-34a和miRNA-29b表达与NSCLC化疗疗效的关系 例(%)

2.4 miRNA-34a的表达和miRNA-29b基因表达的相关性 miRNA-34a和 miRNA-29b在NSCLC细胞中多异步表达，经Spearman等级相关性检验分析，结果表明原发性肺癌组织中miRNA-34a基因的表达和miRNA-29b基因的表达之间呈负相关(r=-0.79，P<0.01)。

3 讨论

miRNAs是一个长度为21～25个核苷酸非编码的小RNA大家族，miRNAs在细胞内具有多种重要的调节作用，它调节着人类1/3的基因，研究表明，许多miRNAs直接参与人类肿瘤(包括结肠癌、肝癌、乳腺癌和肺癌等)的形成，miRNAs在调节肿瘤相关基因表达的同时，其本身也具有癌基因或抑癌基因的特点[9]。约50%有注释的人类miRNAs集中于基因组的脆性位点，随着研究技术的不断发展，越来越多新的miRNAs不断被发现，其中某些miRNA-125b、miRNA-21、miRNA-31、miRNA-34、miRNA-29、miRNA-133和miRNA-294和miRNA-155-5p在大多数肿瘤中呈现高水平表达，并充当癌基因的角色[10]。miRNAs将来是肿瘤治疗的一个非常有效的新靶点之一。miRNAs表达调控的机制十分复杂，主要表现在转录、转录后调控以及基因所在的位置，因此，研究miRNAs和NSCLC癌细胞相关表达是建立更好治疗方法的关键，随着NSCLC癌干细胞与对应的miRNAs表达谱的建立，将对NSCLC的预防与治疗开辟出新的领域。

肿瘤的发生是一个多因素参与、多基因突变、多步骤、多阶段进展的复杂事件；miRNA-29b是一种肿瘤抑制性miRNAs，通过调节多种靶基因参与肿瘤的发生发展及凋亡过程[11]，miRNA-34a与多种癌症发生发展密切相关的miRNA[12]；本研究结果发现，miRNA-29b在NSCLC癌组织标本中低表达，miRNA-34a在NSCLC癌组织标本中高表达，miRNA-34a和 miRNA-29b在NSCLC细胞中多异步表达，临床病理分析，NSCLC癌组织中miRNA-29b表达水平与瘤内微血管密度(MVD)呈负相关，NSCLC癌组织中miRNA-34a表达水平与MVD呈正相关，NSCLC癌组织中miRNA-34a表达水平与miRNA-29b表达水平呈负相关，miR-29b通过抑制血管内皮生长因子-A(VEGF-A)VEGF-A的表达而发挥抑癌作用[13]。我们研究结果发现，鳞癌患者miRNA-34a表达明显高于腺癌患者，鳞癌患者miRNA-29b表达明显低于腺癌患者，提示miRNA-34a水平随疾病进展而升高，miRNA-29b水平随疾病进展而下降，并且与其表达高低与患者的TNM分期及淋巴结转移呈密切相关性，由此可见，miRNA-34a和miRNA-29b水平与肿瘤血管密度和恶性生物学行为明显相关，miRNA-34a过高表达则可能提示肿瘤发生或预示肿瘤的不良转归，其机制可能是miRNA-34a高表达直接引起了肺癌细胞转化，导致肺癌的发生；miRNA-34a是NSCLC的癌基因控制细胞分化促进肿瘤的发展，miRNA-34a 可促进肺癌细胞的浸润及转移。本研究结果又表明，miRNA-29b在NSCLC癌组织内的低表达，可促进NSCLC癌的发生发展，miRNA-29b表达水平越低，则预后越差，根据miRNA沉默基因表达的原理[14]，结合miRNA-29b在肺癌细胞中的低表达，推断miRNA-29b是NSCLC的抑癌基因；miRNA-34a在NSCLC癌组织中高表达能促进肿瘤淋巴结转移进而使临床化疗预后差，多项研究证实miRNA-29b及miRNA-34a与癌细胞的耐药性相关[15]。miRNA-34a与miRNA-29b表达水平能成为反映肺癌生物学行为及侵袭性的重要指标，miRNA-34a与miRNA-29b是NSCLC诊断与预后判断中最具潜力的新型生物标志物之一，通过检miRNA-34a与miRNA-29b表达水平可以对肺癌预后效果进行一定的判断，以更好的指导临床治疗。

综上所述，miRNA-34a的基因表达在NSCLC中高表达，miRNA-29b的基因表达在NSCLC中低表达，它们表达水平有助于临床分期组、织学分级和淋巴结转移的判断，并且miRNA-34a低表达或者miRNA-29b高表达的患者化疗有效率高，是化疗受益的指标之一。

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Expression and clinical significance of miRNA-34a and miRNA-29b in non-small cell lung cancer

ZHAOShucan*,ZHENGDingrong.

*DepartmentofInternalMedicine,CentralHospitalofShantouCity,Guangdong,Shantou515031,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of miRNA-34a and miRNA-29b gene in non-small cell lung cancer (NSCLC),and to explore the correlation between the expressions and clinical features as well as chemotherapy efficacy in patients with NSCLC.Methods Eighty patients with NSCLC who were diagnosed definitely in our hospital were served as experimental group,at the same time, the other 100 patients with lung benign diseases were served as control group. The expression levels of miRNA-34a and miRNA-29b gene were detected by RT-PCR, moreover,the expressions of miRNA-34a and miRNA-29b gene as well as the therapeutic effects of chemotherapy were retrospectively analyzed.Results The expression levels of miRNA-34a in experimental group were significantly higher than those in control group (P<0.05),however, the expression levels of miRNA-29b in experimental group were significantly lower than those in control group (P<0.05). The expression levels of miRNA-34a in adenocarcinoma group and in squamous-cell carcinoma group were significantly higher than those in the other types of lung cancers (P<0.05).Moreover the expression levels of miRNA-34a in adenocarcinoma group were significantly higher than those in squamous-cell carcinoma group (P<0.05), however, the expression levels of miRNA-29b in adenocarcinoma group and in squamous-cell carcinoma group were significantly lower than those in the other types of lung cancers (P<0.05),furthermore,which in adenocarcinoma group were significantly lower than those in squamous-cell carcinoma group (P<0.05). The expressions of miRNA-34a and miRNA-29b were closely correlated with lung tissue grade,TNM stage and lymph node metastasis (P<0.05). The effective rates of chemotherapy in patients with high-expression of miRNA-34a were significantly lower than those of patients with low-expression of miRNA-34a (P<0.05), moreover, the effective rates of chemotherapy in patients with low-expression of miRNA-29b were significantly lower than those of patients with high-expression of miRNA-34a (P<0.05). Besides the expression of miRNA-34a in lung cancer tissues was negatively correlated with that of miRNA-29b (r=-0.79,P<0.01).Conclusion The high-expression of miRNA-34a exists in NSCLC,however,the low-expression of miRNA-29b exists in NSCLC,and their expression levels contribute to the clinical stage,histological grade and lymph node metastasis evaluation,moreover, the patients with low-expression of miRNA-34a and high-expression of miRNA-29b have higher effective rates of chemotherapy,which is regarded as one of the indexes of benefiting from chemotherapy.

non-small cell lung cancer; mRNAs; curative effect; miRNA-34a; miRNA-29b; clinical significance

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.16.008

515031 广东省汕头市中心医院内科综合病区(赵淑灿);广东省深圳市宝安区中心医院社区健康服务管理中心(郑定容)

R 734.2

A

1002-7386(2017)16-2436-04

2017-01-10)