西藏牦牛奶渣优良乳酸菌筛选及混合发酵优化

万金敏，葛武鹏，杨丽娜，王西宁，梁秀珍，王智，秦立虎

（1.西北农林科技大学食品学院，陕西杨凌712100；2.杨凌示范区医院，陕西杨凌712100；3.陕西飞天乳业有限公司，陕西宝鸡721100；4.陕西百跃优利士乳业有限公司，陕西咸阳712000；5.陕西西安市奶牛育种中心，西安710000）

西藏牦牛奶渣优良乳酸菌筛选及混合发酵优化

万金敏1，葛武鹏1，杨丽娜1，王西宁2，梁秀珍3，王智4，秦立虎5

（1.西北农林科技大学食品学院，陕西杨凌712100；2.杨凌示范区医院，陕西杨凌712100；3.陕西飞天乳业有限公司，陕西宝鸡721100；4.陕西百跃优利士乳业有限公司，陕西咸阳712000；5.陕西西安市奶牛育种中心，西安710000）

对从西藏牦牛奶渣中分离出的113株乳酸菌，以牛乳为基质经遗传稳定性、凝乳时间、凝乳酸度、后发酵酸度及组织状态等指标综合评价筛选出5株优良乳酸菌，得到4株乳酸杆菌(B、C、D、E)和1株乳球菌(A)。将4株杆菌与球菌复配，进行组合发酵优化试验。通过发酵乳增菌规律、产酸性能、pH值、产香能力等综合指标加权比较，确定最优组合，为工业化应用提供参考。结果表明：①5株优势菌单株发酵凝乳时间均在4～6 h之间，凝乳酸度在62.57～70.40°T之间，后发酵酸度在96.24～109.20°T；②以活菌数增菌性能和产酸性能为指标进行组合优化，显示AB和AC具有共生关系，在脱脂牛乳中37℃发酵8 h，AB组合活菌数最高，达6.46×109mL-1，AC组合酸度最高，达91.87°T。AB、AC组合发酵性能均优于各单菌株，差异显著（P＜0.05），而AD和AE组合与各单菌株间发酵性能无显著性差异（P＞0.05）。③最优菌种组合为AB（1∶1）复配，凝乳时活菌数为4.57×109mL-1，凝乳酸度为71.54°T，后发酵酸度为115.30°T，发酵乳产品中乙醛质量浓度为36.91 μg/mL、丁二酮质量浓度为13.82 μg/mL，产品质构良好。

牦牛奶渣；乳酸菌；发酵乳；组合发酵

0 引言

自乳酸菌发现以来，研究人员对其代谢途径、发酵性能等方面进行了广泛的研究[1]。西藏高原牧区海拔高，平均气温低，昼夜温差大，紫外辐射强，这些地区传统乳制品中的乳酸菌适应了这一恶劣环境大量存活并繁衍下来，保存了其生物学特性[2]。发酵乳质量的好坏取决于发酵剂的品质、类型及活力[3]。目前我国发酵剂菌种来源多由国外著名菌种供应商主导，因此，从西藏牦牛奶渣中筛选出优良乳酸菌进行组合发酵，开发具有良好发酵性能的复合发酵剂，具有潜在应用价值[4]。

本研究对从奶渣中分离出的113株乳酸菌依据凝乳时间、凝乳酸度、后发酵酸度及发酵乳质构特性筛选得到5株优势乳酸菌，并对其进行组合优化发酵试验，为开发复合发酵剂提供技术依据。

1 实验

1.1 菌种与试剂

113株乳酸菌菌株分离自西藏拉萨市、当雄市、林芝米拉山地区和浪卡子地区的10份样品中。

鲜牛乳由西北农林科技大学畜牧站提供；脱脂乳粉（用于菌种活化）；氢氧化钠、三氯乙酸（TCA）、四硼酸钠、丝氨酸、邻苯二甲醛、酚酞、碘、体积分数为95%乙醇、HCl、丁二酮（标品）、硫酸铁铵等试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

电热恒温培养箱DRP-9162型；紫外分光光度计UV-2802型；数显pH计PHSJ-3F型；分析天平FC104型；高速离心机HC3018型；立式蒸汽灭菌器YXQ-LS-50S11型；双人单面超净台SW-CJ-2D型。

1.3 方法

1.3.1 单个菌株的筛选

（1）菌株遗传稳定性的测定。将乳酸菌接种到MRS液体培养基中培养24 h后，按照3%比例接种于灭菌脱脂乳中37℃发酵，凝乳时记录凝乳时间。然后将其放入4℃冰箱中后发酵24 h，观察凝乳外观、组织状态及乳清晰出等，然后按3%继续接种培养，连续传代20次，淘汰活性差、凝乳质量不稳定的菌株，选择凝乳状态好且遗传性能稳定的菌株。

（2）凝乳时间。将各菌株活化后，以3%的比例接种于灭菌脱脂乳中，置37℃恒温培养箱中发酵，记录凝乳时间。平行3次试验。

（3）凝乳酸度的测定。根据GB 5413.34-2010酸度测定方法，按菌种3%比例接种到12%灭菌脱脂乳中，37℃发酵，用0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定测定，重复3次，其酸度以吉尔涅尔度(°T)[5]。

（4）后发酵酸度的测定。将各菌株对应的发酵剂以3%的比例接种于灭菌脱脂乳中，置37℃恒温培养箱中发酵，待凝固后立即转入4℃冰箱冷藏24 h后，测定滴定酸度。测定方法参考：GB/T 5413.34-2010《乳和乳制品酸度的测定》。

（5）酸乳组织状态。脱脂乳凝固后，分别就色泽、组织状态等进行观察记录。

1.3.2 菌株组合发酵的研究

1.3.2.1 复合菌株产酸能力测定

将活化好的单菌株及按1∶1的比例混合好的菌种分别按3%接种量接种至灭菌脱脂乳培养基，于37℃恒温培养箱培养，每隔1 h取三个平行样品测定活菌数、pH值、滴定酸度，连续测定8 h，并作8 h内的生长变化规律表和产酸性能图。通过试验筛选出有协同作用的菌株组合。

1.3.2.2 复合菌株比例的筛选

将上述具有协同作用的杆菌与球菌分别按照1∶1，1∶2，1∶3，2∶1及3∶1的比例制作发酵剂，接种于灭菌脱脂乳中，凝乳后，记录其凝乳时间，并测定凝乳酸度，置于4℃冰箱中，后发酵24 h后，测定其活菌数、后发酵滴定酸度、乙醛及丁二酮值，并进行感官评分。同时跟4株单菌株及普通酸奶发酵剂（嗜热链球菌：保加利亚乳杆菌(YC)=1∶1）制作的发酵乳各指标进行对比。通过将活菌数、凝乳酸度、后酸化滴定酸度、乙醛、丁二酮进行加权计分，从而筛选出综合指标最优的比例组合，同时跟感官评分进行比较和验证。

1.3.2.3 活菌数测定

根据GB4789.35-2010《食品微生物学检验乳酸菌检验》方法进行测定[6]。

1.3.2.4 乙醛含量测定

取适量试样，与16%TCA等体积混匀，3 500 r/min离心10 min，取上清液25 mL于碘量瓶中，加入1% NaHSO3溶液5 mL，摇匀，暗处放置1 h。加入1%淀粉溶液1 mL，用0.1 mol/L碘液滴定至接近无色，再改用0.01 mol/L碘溶液滴定淡蓝色出现。再加入1 mol/L的NaHCO3溶液20 mL，振荡混匀，用0.01 mol/L碘标准溶液滴定至淡蓝色再次出现，记录消耗的碘液的体积[10]。同时做空白实验，平行3次。

乙醛含量计算公式

乙醛(g/mL)=﹝(V1—V2)C×0.022﹞/25

V2为空白滴定消耗I2标准溶液的体积(mL)；V1为样品滴定消耗I2标准溶液的体积(mL)；C为I2标准溶液的浓度(mol/L)；25为乙醛样品称样量(mL)；0.022为乙醛化学反应基本单位(g)。

1.3.2.5 丁二酮含量测定

取待测乳样，加等体积16%TCA溶液，混匀，3 500 r/min离心10 min，取上清液5mL，分别加入0.25 mL 1 g/100 mL的邻苯二胺溶液，摇匀后置于黑暗处放于30 min，然后加入1.0 mL 4.0 mol/L HCl溶液以终止反应，混匀后在335 nm波长处用石英比色皿测定吸光度。每个样品做3次平行。然后查丁二酮标准曲线可获得待测样品中丁二酮质量浓度[7-8]。

标准曲线制作：配制不同质量浓度的丁二酮标准液，然后按照样品上述方法操作，在335 nm波长处测得各标准液的吸光度，平行测定3次。以丁二酮质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示。

图1 标准曲线-丁二酮质量浓度与吸光值关系

1.3.2.6 感官评分

主要评估发酵乳产品的风味和质地特征，待乳酸菌发酵的全脂乳凝固后，放入冰箱4℃冷藏24 h后发酵，成品由12人小组进行感官评价，感官评分表参照POURAHMAD R和孙福春[9-10]。

表1 筛选结果

2 结果与分析

2.1 单菌株筛选结果

对分离自西藏牦牛奶渣的113株乳酸菌分别转接20次以后，确定其发酵遗传稳定性，剔除不稳定菌株后，以凝乳时间、凝乳酸度、后酸化酸度及其组织状态为指标，筛选出了5株发酵性能良好的优势菌株，分别是GY-L109、GY-L003、GY-L004、GY-L055、GY-L112，见表1。

在凝乳过程中，凝乳时间太短或太长，都对发酵乳的品质有一定影响。凝乳时间太短，不利于风味物质的形成，且对发酵乳质构特性也会产生不良的影响；凝乳时间过长，虽然对状态和香味有一定的促进作用，但增大了发酵过程染菌几率，且生产效率下降，不利于节约能源和时间[11]。因此本研究中选取凝乳时间3～6 h的乳酸菌作为初筛标准。

乳酸菌的产酸性能直接关系到发酵乳质量，菌株的产酸特性是筛选菌种的重要指标之一[12]。一般发酵乳国标要求的酸度为70～110°T，本试验优选的5个菌株凝乳酸度均在62～71°T之间，基本符合酸度要求，且在实际生产中一般采用两种及两种以上的菌株复合发酵，可以弥补单菌株产酸不足的缺陷[13]。4℃冷藏24 h完成了后发酵阶段，滴定酸度会明显增加，波动范围在96～110°T之间。各单株制成的发酵乳成品质构可接受，状态基本细腻，风味可接受，基本无乳清晰出，表明该5株乳酸菌初步具备制作生产发酵剂的潜力。

2.2 优化发酵筛查优势组合

5株优势菌株A为乳酸球菌，B、C、D、E均为乳酸杆菌，按照球菌、杆菌互补原则将球杆菌分别以1∶1比例进行组合，组成了AB、AC、AD及AE复配组合，制作复合发酵剂，以单菌株发酵为参比，按接种量3%接于灭菌后的脱脂乳中，37℃下发酵，定时测定8h内的活菌数、pH及滴定酸度等参数，以活菌数增菌特性和产酸特性评价优化效果。

2.2.1 单菌株和复合菌株增菌变化情况

由表2可以看出，单株菌与1∶1复合株随着发酵时间延长各菌株的生长趋势高度一致，0～4 h内增菌快速，5～8 h增菌趋势变缓。其中，单株A活菌数最高，8 h后达4.79×109mL-1，其余各单株8 h发酵活菌数均达109数量级。AB组合活菌数均高于各自单株(P＜0.05)，8 h达6.46×109mL-1。0～3 h，AC组合活菌数与各自单株接近(P＞0.05)，而在4～8 h间组合优势显现，活菌数明显高于各自单株。而AD和AE组合未显现出复配优势，无共生关系。

2.2.2 单菌株和复合菌株产酸性能比较

乳酸菌的产酸性能是筛选发酵乳发酵剂的关键指标。每株乳酸菌产酸能力不尽相同。发酵过程中，单株和复合株的pH和滴定酸度的变化趋势基本一致。图2、3、4、5显示了两两组合与各自单株发酵过程中的酸度和pH变化情况，其中，以AB、AC组合较为理想，AB组合滴定酸度始终显著高于各自单株A和B(P＜0.05)，8 h时达到最高91.34°T。pH变化在初期发酵的2 h内组合与单株基本一致，2 h后AB组合明显优于各自单株，最低pH为4.14。AC组合4～5 h滴定酸度介于A和C之间，其余显著高于A和C(P＜0.05)。最终为91.87°T。AC的pH下降速率显著高于A和C(P＜0.05)。8 h时pH为4.11。表明AB、AC组合发酵性能良好，具有共生关系。AD组合滴定酸度始终显著低于A和D(P＜0.05)，三组的pH值接近，差异不显著(P＞0.05)。发酵初期，AE组合滴定酸度介于A和E之间，之后AE滴定酸度低于单菌株。pH下降速率显著低于A和E(P＜0.05)。AD、AE组合未体现出复合共生关系。

表2 发酵过程中乳酸菌活菌数的生长变化

图2 A和B及AB在发酵过程中pH值、滴定酸度的变化

图3 A和C及AC在发酵过程中pH值、滴定酸度的变化

图4 A和D及AD在发酵过程中pH值、滴定酸度的变化

图5 A和E及AE在发酵过程中pH值、滴定酸度的变化

尽管许多微生物之间存在协同共生作用，但并非所有的菌株都会有共生关系，有些菌株之间可能还存在不同程度的拮抗作用。因此，菌种复配是应注意使各菌株间产生理想的共生效果而不是彼此竞争[14]。由表2和图2-图5看出，复合株AB和AC的活菌数相比于各单株约在3～4 h后有明显增多的趋势，且产酸能力亦均高于各单株，而复合株AD和AE的活菌数与单株的差异不显著，且产酸能力弱于单菌株。藉此判定，A与B、C复合具有一定共生关系。

2.3 优势组合复配比例研究

依据影响重要性综合考量的各指标权重分配分别为活菌数0.2、凝乳酸度0.3、后发酵酸度0.3、乙醛0.1、丁二酮0.1，表3展示了各指标值、加权得分和感官评分结果。

由表3可以看出，活菌数、凝乳酸度、后发酵酸度、乙醛、丁二酮等各个指标单株及复合株间均存在不同差异。

乳酸菌活菌数是体现活性发酵乳保健功能的重要指标之一。其活菌数高低直接影响着发酵乳的品质和促健康效能。国标（GB19302-2010）中亦有严格规定，要求活菌型发酵乳活菌数大于106mL-1。因此，仅从活菌数看，以AB（1∶2）复配及AC（3∶1）复配，表现最优，分别可达6.61×109mL-1和6.03×109mL-1，AB（1∶1）、AC（1∶1）组合次之，但亦均达到了109数量级，它们之间无显著性差异。

表3 不同菌株的发酵乳各项指标的测定结果及感官评分

凝乳酸度比较与活菌数之间的比较结果相近，优选的AB（1∶1）、AB（3∶1）和AC（1∶1）组合制成的发酵乳之间差异不显著（P＞0.05），但均显著高于其它复合株；后发酵酸度比较发现，复合菌AB（1∶1）和AC（1∶1）均显著高于其他单株或复合株，其中AB（1∶1）复配的后发酵酸度最高，为115.30°T。

风味物质组成与含量是评价一种发酵乳优劣的另一重要指标，目前发酵乳制品中已鉴定出有90多种与风味有关的挥发性化合物[15]，典型的发酵乳风味主要来自于乳酸菌发酵过程中产生的乳酸和各种羰基化合物，其中乙醛和双乙酰被认为是构成发酵乳风味的主要成分[16]。乙醛对发酵乳的风味影响最大，双乙酰对发酵乳饱满风味的形成有重要作用[17-18]。不同的研究结果显示乙醛和丁二酮质量浓度及比例均有一定差异，复合AB（1∶1）及AC（1∶1）发酵乳之间的乙醛质量浓度显著高于其他复合株，分别为36.91 μg/mL和34.81 μg/mL，AB（1∶2）次之，AC（2∶1）质量浓度最低，为23.71 μg/mL，复合株AB（1∶1）发酵乳的丁二酮质量浓度最高，为13.82 μg/mL，而复合株AB（1∶2）发酵乳的质量浓度最低为7.96 μg/mL。不难发现本研究复配组合AB（1:1）制成的发酵乳乙醛和丁二酮生成量处于较高水平，与秦虹等[19]用甘肃藏区自然发酵牦牛乳中的优良乳酸菌制作酸乳，产生的乙醛和双乙酰质量浓度分别为11～42.68 μg/mL和2.91～13.18 μg/mL和尚玉琳等[20]用保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌组合发酵酸乳时，酸乳中乙醛质量浓度在17.5～25.3 μg/mL之间，双乙酰质量浓度在2.0～3.7 μg/mL之间研究相比较，本研究复配的发酵剂AB产香性能更为优良。

表3中感官评分结果分析表明，以AB（1∶1）制作的发酵乳，评分最高，产品质构特性最优，具有发酵乳特有的滋味和气味，酸甜适度，组织细腻均匀，无乳清析出。

综合以上各项分析结果认为以AB（1∶1）组合最优，显现出较好的发酵性能和产香能力，具有良好共生关系。

3 结论

（1）对113株牦牛奶渣中的乳酸菌，通过凝乳时间、滴定酸度及感官评价等综合指标优选出5株优势菌。其共性特征是凝乳时间在4～6 h之间；凝乳酸度在64.17～69.24°T之间。

（2）单菌株与复合株的增菌规律及产酸性能趋势一致。在脱脂牛乳中37℃发酵8 h，单菌株A活菌数最高为4.79×109mL-1，复合株AB活菌数最高为6.46×109mL-1；AC组合凝乳酸度最高，达91.87°T。AB和AC组合增菌能力及产酸能力均优于各单菌株，差异显著（P＜0.05），而AD和AE组合与各单菌株间发酵性能无显著性差异（P＞0.05）。

（3）最优菌种组合为AB（1∶1），活菌数为4.57× 109mL-1，凝乳酸度为71.54°T，后发酵酸度为115.30°T；发酵乳产品中乙醛质量浓度为36.91 μg/mL，丁二酮质量浓度为13.82 μg/mL，滋气味浓郁饱满，酸甜适度，组织细腻，无乳清析出。

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Screening of Lactic acid bacteria by high fermentation performance from yak milk dreg in tibet and optimization of combined fermentation with mixed LAB

WAN Jinmin1，GE Wupeng1，YANG Lina1，WANG Xining2，LIANG Xiuzhen3，WANG Zhi4，QIN Lihu5
(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.Yangling Model District Hospital,Yangling 712100,China;3.Shaanxi Feitian Dairy Co.,Ltd.,Baoji 721100,China;4.Shaanxi BaiYue You Lishi Dairy Co.,Ltd.,Xianyang 712000,China;5.Shaanxi Xi’an Dairy Breeding Center,Xi’an710000,China)

A total of 113 strains of Lactic acid bacteria(LAB)were isolated from yak milk dreg in Tibet.Five LAB strains showing better fermen⁃tation performance were obtained through preliminary selection by genetic stability,coagulation time,titratable acidity and sensory evalua⁃tion.There were 4 strains of Lactobacillus(B、C、D、E)and one strain of Staphylococcus(A).They were used in combination to fermented dairy flavor.Optimal fermentation strain combination was obtained throughgrowth and acidic performance,pH,the composite ratio of strains and the content of acetaldehyde and diacetyl.The results showing that:①The curd time and titratable acidity of the 5 strains were 4 to 6 h and 62.57 to 70.40°T;After refrigeration 24 h,titratable acidity were 96.24 to 109.20°T;②The number of live bacteria enrichment perfor⁃mance and acid production performance index of combinatorial optimization,showed that AB and AC have a good symbiotic relationship. After fermentation of 8 h in skim milk,AB of the highest number of viable cells was 6.46×109mL-1,AC combination of curd acidity was highest.The performance of AC and AB combinations were superior to those of single strains,and the difference was significant(P＜0.05). While there was no significant difference in the fermentation performance between AD and AE(P＞0.05);③The optimal strain combination was AB(1∶1).The number of live bacteria was up to 4.57×109mL-1,curd acidity and after fermentation acidity were 71.54°T,115.30°T.The ac⁃etaldehyde content of fermented milk products was 36.91 μg/mL and the content of butanedione was 13.82 μg/mL.

yak milk dreg;Lactic acid bacteria;fermented milk yogurt;mixed-culture fermentation

Q93-331

：A

：1001-2230（2017）06-0004-05

2016-11-30

陕西省科技厅战略性新兴产业重大产品（群）项目(2015KTCQ 03-08)及（2016KTCQ03-03）。

万金敏(1990-)，女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

葛武鹏