5种乳源乳脂肪球膜的组成和性质

2017-08-07 10:32
中国乳品工业 2017年6期
关键词:极性磷脂牦牛

(哈尔滨工业大学化工与化学学院,哈尔滨150090)

5种乳源乳脂肪球膜的组成和性质

姬晓曦,马莺

(哈尔滨工业大学化工与化学学院,哈尔滨150090)

从5种原乳(牛、山羊、水牛、牦牛和骆驼乳)中分离出乳脂肪球膜(MFGM)。对5种MFGM中蛋白质、氨基酸、脂质、多糖、微量元素和灰分的质量分数进行了分离和测定。对5种MFGM组分的对比结果显示,5种MFGM之间各组分差异显著(p<0.05)。本研究旨为进一步研究MFGM蛋白质组和功能特性提供借鉴。

牛乳;山羊乳;水牛乳;牦牛乳;骆驼乳;乳脂肪球膜

0 引言

乳营养价值全面,是人体生长发育和身体健康的重要营养来源。乳脂肪以脂肪球形式存在,脂肪球表面被生物膜包围,被称为脂肪球膜(Milk Fat Globule Membrane,MFGM),其厚约5~10 nm[1],由蛋白质、磷脂、糖蛋白、维生素等复杂化合物组成[2],含有独特的极性脂质和膜特异性蛋白。MFGM中的磷脂、鞘磷脂、鞘糖脂、糖蛋白等具有治疗心肌梗塞,调控胆固醇代谢,及抑制某些肿瘤细胞的作用[3-5],其组成和含量与动物种类、季节、饲料、泌乳阶段和分离方法等有关[6]。

目前,关于牛、山羊、水牛MFGM组成及特性方面的报道很多,但对牦牛和骆驼MFGM特性的研究有限。本研究从牛、山羊、水牛、牦牛和骆驼乳中分离出MFGM,对5种MFGM的蛋白质、脂质、多糖、微量元素等组分的质量分数进行测定并比较。通过了解不同MFGM的组成和特性,为进一步研究MFGM蛋白质组学及其功能特性的应用奠定基础。

1 实验

1.1 仪器

低速台式大容量多管离心机(TLXJ-IIC),氨基酸分析仪(L-8800),马弗炉(XS),电感耦合等离子发射光谱(Varian 700-ES)等。

1.2 原料的采集

牛乳和山羊乳采自黑龙江省哈尔滨市江北区牧场;水牛乳采自广西水牛研究所牧场;牦牛乳采自四川阿坝州红原县一家庭牧场;骆驼乳(双驼峰)采自内蒙古锡林郭勒盟苏尼特左旗一家庭牧场。所有采集样品为混合样品。收集后置于4°C保温箱于24 h内运回实验室进行MFGM的提取。

1.3 乳脂肪球膜的提取

参考Salvatore Pisanu等人[7]的方法,采用组织破碎的方式提取MFGM,冻干后置于-20°C贮存备用。

1.4 乳脂肪球膜成分的测定

蛋白质质量分数的测定采用凯氏定氮法(GB 50095-2010)[8]。氨基酸质量分数测定参照张华等人的方法[9]。总脂质的测定采用酸水解法(GB/T 5009.6-2003)[10];中性脂质量分数测定是将提取出的MFGM总脂质用硅胶柱层析其中的极性脂,用氯仿洗脱,旋蒸后称重即为中性脂质量分数[11];极性脂的测定是用有机溶剂提取极性脂,用氮吹去除有机相,称重即为极性脂质量分数[12];磷脂是先测定极性脂中P元素的质量分数,换算相应的稀释倍数后乘以参数25,即为总磷脂质量分数[13]。多糖含量的测定是以等质量半乳糖和甘露糖的混合物为标准品,于490 nm处测定吸光度,制作标准曲线,将样品的吸光度带入标准曲线中求得多糖的质量分数[14]。采用ICP-OES测定MFGM中10种微量元素的质量分数[15]。采用高温灼烧法测定MFGM中灰分的质量分数(GB50094-2010)[16]

1.5 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析,用Tukey HSD法进行多重比较,结果用“数据平均值±标准差”表示;采用Origin 8.5软件对结果作图。

2 结果与分析

2.1 乳脂肪球膜含量

对5种MFGM的分离结果如表1所示。

表1 5种乳的脂肪球膜质量分数%

由表1可以看出,5种MFGM在乳中的质量分数差异显著(P<0.05),在2.07%~2.99%(占脂肪球质量)。20世纪70年代Mulder等人根据对多篇文献的汇总得出,牛MFGM质量分数为0.5%~1.5%脂肪,这种差异范围与MFGM的分离方法有关[17]。但是关于其他哺乳动物MFGM分数的文献报道有限。脂肪球是在上皮细胞的分泌过程中,表面被包裹上MFGM[18]。哺乳动物乳腺分泌MFGM的量并不随着脂肪量的增加而增加,如果脂肪分泌量增加则必须形成大的脂肪球才能被有限量的MFGM所覆盖,这一点也解释了脂肪质量分数与脂肪球大小呈正相关的现象[19-20]。MFGM的分泌还与哺乳动物的生理状况和激素水平有关[21,22]。因此,在不同种类乳的MFGM占总脂肪的质量分数之间还是存在一定的差异。

2.2 蛋白质含量

MFGM蛋白仅占乳中总蛋白的1%~2%,但是MFGM蛋白种类繁多,以糖蛋白和酶为主,且在蛋白质组成上独特,脱脂乳中绝不含有MFGM蛋白组分[17]。5种MFGM蛋白质含量如表2所示。

表2 5种乳脂肪球膜的蛋白质质量分数%

由表2可以看出,5种MFGM的蛋白质质量分数差异显著(P<0.05),水牛和牦牛MFGM的蛋白质量分数显著高于其他3种样品,山羊MFGM蛋白质量分数最低(30.26%)。由于MFGM蛋白质量分数在很大程度上取决于MFGM的分离方法和蛋白质的分析方法,因此文献报道的每种乳的MFGM蛋白质量分数范围较宽[17,23-24]。MFGM中的蛋白质以多种方式与膜结合,如整合蛋白、外周蛋白,以及松散附着在MFGM上的蛋白质。其中外周蛋白是松散结合在膜上,执行着重要生理功能,是数量最多的膜蛋白组分。SDS-PAGE电泳分析可以确定主要的MFGM蛋白质为嗜乳脂蛋白、黄嘌呤氧化还原酶、黏液素、脂肪滴结合蛋白等[18]。关于水牛、山羊、骆驼和牦牛MFGM中蛋白质质量分数的报道很少,但是基于SDS-PAGE电泳方法,分离得到的蛋白成分与牛乳基本相同[17]。近年来研究表明MFGM蛋白具有抗癌[25]、杀菌[26]、提高免疫力[27]等多重作用。

2.3 氨基酸含量

构成膜蛋白的氨基酸在组成与含量上与乳蛋白之间存在一定的差异。对5种MFGM蛋白氨基酸的组成和含量进行的分析结果如表3所示。

表3 5种乳脂肪球膜氨基酸的组成及相对质量分数%

由表3可以看出,5种MFGM中均未检出蛋氨酸,除牛乳外,其他4种MFGM中均未检出酪氨酸,牦牛和骆驼MFGM中未检出脯氨酸,牦牛MFGM中未检出半胱氨酸;而在上述5种乳的乳蛋白中均含有这18种氨基酸[28,29]。关于MFGM蛋白氨基酸组成的报道非常有限,何胜华等人对牦牛MFGM蛋白的氨基酸组成进行了分析,只检测出15种[30]。Haramizu等人则从牛MFGM中检测到18种氨基酸[5]。5种MFGM蛋白中非必需氨基酸、芳香族氨基酸和支链氨基酸的含量差异显著(P<0.05),牛和水牛MFGM中的必需氨基酸差异不显著(P>0.05),但显著高于山羊、骆驼和牦牛MFGM。MFGM蛋白氨基酸的组成和质量分数与MFGM的纯度有关,因此,不同分离方法得到的MFGM氨基酸组成和质量分数差异较大。

2.4 脂质质量分数

MFGM的脂类物质主要是极性脂,还有少量的中性脂质。MFGM是由蛋白磷脂膜构成的三层膜结构,磷脂是稳定膜的结构及乳化稳定性方面起着重要的作用,膜磷脂也具有重要的生理功能。采用柱色谱分离和化学法测定了5种MFGM总脂质、极性脂质、中性脂质和总磷脂的质量分数,以及磷脂占极性脂质的比例如表4所示。

表4 5种乳脂肪球膜各种脂质的比例%

由表4可以看出,山羊和牦牛MFGM脂质总量显著高于其他样品(P<0.05)。在5种MFGM脂质中,中性脂质的质量分数显著高于极性脂质,中性脂质占总脂质的比例在62%~80%之间(表4),山羊和牦牛MFGM中性脂质质量分数显著高于其他样品(P<0.05);而在极性脂质中,牛和水牛MFGM中极性脂质质量分数显著地高于其他样品(P<0.05)。磷脂是极性脂质的主要成分,约占极性脂质的85%~98%,水牛MFGM中磷脂质量分数最高,其次是牛、牦牛和骆驼样品,山羊样品中质量分数最低,但是在山羊MFGM中磷脂占极性脂质的比例高达98.35%。

MFGM的中性脂主要是一些三酰基甘油酯、二酰基甘油酯、一酰基甘油酯、胆固醇和其他酯类物质组成,其中甘油三酸酯是中性脂质的主要成分。MFGM中的三酰基甘油酯主要是由长链饱和脂肪酸(棕榈酸和硬脂酸)组成,与脂肪球内的脂肪在脂肪酸组成上完全不同[31],这些高熔点固态三酰基甘油酯对MFGM的稳定性和完整性起着重要的作用[23]。文献报道MFGM的中性脂质在20%~80%,其质量分数取决于MFGM的分离方法[32]。本研究测定的5种乳的MFGM中性脂质在32.50%~51.59%,但仍然有一部分中性脂质,尤其是三酰基甘油酯主要来源于乳脂肪;一些高熔点的三酰基甘油酯在MFGM的内壁含量较高,很难从膜中分离出去[23]。

MFGM的极性脂质包含磷脂类和神经鞘脂类。两者都是具有亲水基团和疏水基团的两性分子。极性脂是构成MFGM主体结构的主要成分,不同的极性脂成分具备不同的功能性质,极性脂成分在很大程度上影响了MFGM的微观结构[12],磷脂主要包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、神经鞘磷脂、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸,而且,膜磷脂分子中的脂肪酸主要是由长链饱和脂肪酸组成(棕榈酸、硬脂酸和二十三烷酸),短链脂肪酸的质量分数非常低。神经鞘磷脂的特殊结构单元是鞘氨醇基,它有一个长链脂肪族胺,包含两个或三个羟基,当鞘氨醇基的氨基与脂肪酸连接时就形成了神经酰胺,进而通过连接不同有机磷酸酯基团形成鞘磷脂(如连接磷酸胆碱后形成的神经鞘磷脂)或连接糖类后形成糖脂(神经酰胺寡糖苷)[18]。由于极性脂质分子的双亲特性,在乳中起着乳化剂和稳定剂的作用,以保持MFGM的正常形态。乳中60%以上的磷脂存在于MFGM中,其它的磷脂存在于乳水相中,这种特殊的区域分布对乳体系的稳定性起着至关重要的作用[31,33]。关于牦牛乳和骆驼乳MFGM极性脂质和磷脂的组成和质量分数的文献报道有限,但是本文测定的牛乳、水牛和山羊乳的MFGM极性脂质和磷脂的质量分数与文献报道基本一致[23,34-35]。尽管,MFGM极性脂质和磷脂质量分数的文献报道数据差异很大,但是对MFGM极性脂质和磷脂等相关数据的分析,对了解不同来源的MFGM结构和功能具有重要的意义。

2.5 多糖质量分数

MFGM富含以糖基化为主的蛋白和脂质,衍生出的糖基化蛋白和脂质具有重要的生理功能[36]。测定的5种MFGM多糖质量分数如图1所示。

图1 5种乳脂肪球膜的多糖质量分数

图1中,a~d不同字母表示差异显著(P<0.05)。由图1可以看出,5种MFGM多糖质量分数差异显著(P<0.05),牛MFGM多糖(8.54 mg/g±0.28 mg/g)显著高于其他4种样品,是山羊和牦牛样品的2.5倍以上;其次是骆驼(5.90 mg/g±0.17 mg/g)和水牛(5.06 mg/g±0.21 mg/g)MFGM,山羊(2.96±0.05 mg/g)和牦牛(3.16 mg/g±0.14 mg/g)MFGM多糖质量分数最低,且差异不显著(P>0.05)。

MFGM中的糖主要是与蛋白和脂质结合在一起,以糖蛋白和糖脂的形式存在。MFGM中的糖脂主要是鞘糖脂,由一个神经酰胺的骨架与一个或多个糖基连接形成,由糖链构成的极性端伸向细胞质膜外,成为细胞表面具有生物活性的标志[37]。葡萄糖神经酰胺和乳糖神经酰胺是两种主要的鞘糖脂,而中性鞘磷脂含有更复杂的低聚糖结构。虽然这些糖脂在MFGM中的含量较低,但是糖脂的降解产物具有重要的生物学作用,如细胞之间的相互作用、分化作用、跨膜信号传导等[36]。MFGM中的鞘磷脂和神经鞘磷脂主要含有长链脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸、二十三烷酸和二十四碳一烯酸),这一特性与磷脂相同[23]。此外,MFGM中另一种糖的来源是糖蛋白,MFGM中糖蛋白的质量分数显著高于糖脂,典型的糖基化蛋白如黏蛋白、嗜乳脂蛋白、分化抗原簇、乳脂肪球表面因子8和PAS6/7等[36]。

关于MFGM中糖脂的研究,更多是关于人乳和牛乳的报道[36],Zancada等人在绵羊乳中检测到鞘磷脂,其质量分数与人乳相近,且人乳中的糖脂质量分数与泌乳期有关,初乳中的鞘磷脂显著高于常乳[38]。何胜华等采用苯酚-硫酸法测定了麦洼牦牛MFGM中多糖的质量分数约为0.1 mg/g[30],与本实验测定结果相差较大,这种差异与乳样来源和MFGM分离方法密切相关。多糖的质量分数与哺乳动物的品种、泌乳期,分离和分析方法等多种因素有关,但是可以确定的是MFGM的生物学功能与糖脂和糖蛋白直接相关,因此,本研究中对不同MFGM多糖质量分数的分析,可以为进一步了解功能性糖脂和糖蛋白提供理论基础。

2.6 微量元素和灰分质量分数

除乳液中的磷酸盐和柠檬酸盐等无机盐以及酪蛋白胶束中的Ca、Mg等以外,MFGM中还有部分微量元素。MFGM中灰分及微量元素的测定结果如表5所示。

表5 5种乳脂肪球膜灰分和元素

由表5可以看出,牛和水牛MFGM灰分质量分数最高,其次是骆驼样品,牦牛和山羊MFGM最低,约是牛和水牛MFGM的40%。除牦牛和骆驼MFGM外,所有待测元素在牛、山羊和水牛MFGM中均有检出。

牦牛MFGM中未检出Fe,Mg,Mn和Zn;骆驼MFGM中未检出Cu,Fe,Mn和Zn。5种MFGM中P,Ca,K和Na质量分数相对较高,其中水牛样品中K质量分数(73.5 μ g/g)显著高于其他样品,是牦牛MFGM的35倍。水牛MFGM的Ca质量分数最高(34.5 μ g/g),其次为骆驼MFGM,质量分数最少的是牦牛MFGM(2.2 μ g/g)。牦牛样品中除Na外,其他元素的质量分数均显著低于其他4种乳,这一结果与牦牛MFGM灰分质量分数较低相一致。

MFGM中Cu,Ca,Na,K,Mg,Mn,Zn等元素主要存在于酶中,如Zn和Mg是在碱性磷酸酶中,黄嘌呤氧化还原酶、过氧化氢酶和乳过氧化物酶中含有Fe[17]。元素P在5种样品中质量分数均较高,且差异显著(P<0.05),顺序为牛乳>水牛乳>骆驼乳>山羊乳>牦牛乳;牛MFGM的P质量分数(267.2±18.2 μg/g)是牦牛的3倍(72.7±3.8 μg/g)。MFGM中的P含量体现在膜磷脂的质量分数。磷脂是MFGM重要的组成部分,乳中60%以上的P都分布在膜上,是构成膜双分子层基本骨架的重要组分,对稳定脂肪球发挥了非常重要的作用。此外,膜磷脂可以促进细胞间的相互作用、细胞分化及细胞凋亡作用,神经鞘脂类能够通过争夺或充当细胞结合位点,抵抗细菌、病毒感染,进而达到杀菌作用[18]。动物的生理状况、泌乳期、加工处理等,都会对MFGM的成分产生影响[39],因此,MFGM中微量元素的质量分数与物种、泌乳阶段、饲料、季节和乳畜健康状况等因素密切相关。对MFGM中微量元素的组成、质量分数和作用方面的报道非常有限,且由于样本量的限制,本研究测定的数据并不能完全反应这5种MFGM中元素的特征,仅为后续研究提供基础数据的参考。

3 结论

由于物种的差异,5种乳脂肪球膜蛋白和脂质以及磷脂质量分数存在一定的差异;5种乳脂肪球膜蛋白均不含有蛋氨酸,酪氨酸是牦牛、山羊、水牛和骆驼乳脂肪球膜蛋白的限制性氨基酸;乳脂肪球膜中多糖质量分数顺序为:牛乳>骆驼乳>水牛乳>山羊乳>牦牛乳;水牛和牛MFGM中P的质量分数显著地高于其它牦牛、山羊和骆驼。本研究的数据为进一步认识乳脂肪球膜的功能和性质提供了基础。

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Compositons and properties of milk fat globule membrane from five different species milk

JI Xiaoxi,MA Ying
(Chemical Engineering and Technology,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

In this research,milk fat globule membrane(MFGM)was separated from five different species raw milk(cow,goat,buffalo,yak and camel).Compositions of MFGM from five species milk,include protein,amino acid,lipid,polysaccharide,microelement and ash,were separated and analyzed.Comparison results showed that the differences of compositions in five MFGMs were significant(p<0.05).Basic data and theory basis were provided in this study for the further research on MFGM poteomics and functional features.

cow milk;goat milk;buffalo milk;yak milk;camel milk;MFGM

Q93-331

:A

:1001-2230(2017)06-0019-05

2016-11-30

姬晓曦(1983-),女,博士研究生,研究方向为食品科学。

马莺

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