SPME-GC-MS法分析不同菌种比例混合发酵对酸乳风味的影响

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

SPME-GC-MS法分析不同菌种比例混合发酵对酸乳风味的影响

靳汝霖，武士美，任为一，丹彤，孙天松

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

∶探讨了不同比例德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌混合发酵对发酵乳风味的影响。以三种不同比例（1∶10，1∶100，1∶1000）的德氏乳杆菌保加利亚亚种IMAU20240和嗜热链球菌IMAU40040的混合发酵乳为研究对象，采用固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术（SPME-GC-MS），并结合内标法对各复配发酵乳中的挥发性风味物质进行分析测定。结果表明，三种比例的复配组发酵乳中主要挥发性风味物质是由酸类、醇类、酮类、醛类以及酯类等化合物组成，且各复配组发酵乳在贮藏期间主要挥发性风味化合物的种类和数量存在明显差异，其中1∶100复配组的发酵乳中主要挥发性风味化合物有乙酸、乙偶姻、乙醛、己醇、甲酸乙烯酯及3-甲基-1-丁醇等，且含量高于其他复配组，是理想的组合。

∶发酵乳；挥发性风味物质；固相微萃取（SPME）；气相色谱-质谱法（GC-MS）

0 引言

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）协同发酵牛乳，可产生少量副产物，并形成发酵乳的风味物质[1-2]，其中，挥发性风味物质对发酵乳风味的形成具有决定性作用[3]。已报道的有关发酵乳中挥发性风味物质的研究中，只将少数含量很高的几种化合物作为主要的风味物质，如Gallardo-Escamilla等[4]在分析发酵乳清液的风味时，发现其主要特征风味物质有乙醛、双乙酰、乙偶姻、乙酸等；王伟君等[5]在嗜热链球菌发酵乳中共鉴定出13种相关风味成分，其中主要风味物质有2，3-丁二酮、2，3-戊二酮等。本研究将德氏乳杆菌保加利亚亚种IMAU20240和嗜热链球菌IMAU40040分别以1∶10、1∶100和1∶1000的比例进行复配发酵，采用固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术（SPME-GC-MS），并结合内标法对其进行定性和定量分析。通过分析三个复配组发酵乳风味的构成及特点，旨在改善发酵乳的风味品质，为乳酸菌发酵剂的筛选及应用提供理论依据。

1 实验

1.1 菌株

本实验所用的发酵菌株嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）IMAU40040（Genbank号∶FJ749316）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bul⁃garicus）IMAU20240（Genbank号∶HM057974）由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。

1.2 材料与培养基

全脂乳粉，MRS液体培养基，M17液体培养基，C3～C20正构烷烃（色谱纯），1，2-二氯苯（标准品）。

1.3 仪器设备

雷磁pH计，气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7890B GC system-5977A MSD），色谱柱为HP-5毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），手动固相微萃取（SPME）进样手柄，萃取头（65 μm PDMS/DVB）。

1.4 方法

1.4.1 菌种活化和菌悬液的制备

将菌种保藏管中的嗜热链球菌IMAU40040和德氏乳杆菌保加利亚亚种IMAU20240分别在脱脂乳培养基（10%脱脂乳，0.1%酵母粉）中活化，再分别转接于M17和MRS液体培养基活化三代，使菌株活力达到最大。将菌株分别于50，100 mL和200 mL的MRS液体培养基中连续扩大培养，经转速为4 000 r/min离心10 min，收集菌体沉淀，用灭菌的PBS缓冲液洗涤去除培养基成分，置于PBS保护液，制得菌悬液于4℃保存，12 h内使用。

1.4.2 发酵乳制备

将蒸馏水预热至50℃加入11.5%的全脂乳粉混匀，待温度上升至60℃，加入质量分数为6.5%蔗糖，水和30 min后均质（低压15 MPa，高压35 MPa），接着90～95℃杀菌5～10 min，待冷却至42℃，接种并分装于样品瓶恒温发酵至pH值小于4.5且酸度大于70°T（发酵终点），转移至4℃贮藏12 h。

接种∶将5×106g-1的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌按1∶10，1∶100，1∶1000的比例接入灭菌后的全脂乳（非脂乳固体质量分数为13.87%，脂肪质量分数为3.08%）中。发酵完毕的发酵乳于4℃贮藏12 h后取样，-20℃保藏。

1.4.3 样品前处理

样品中加入0.05 mL 1，2-二氯苯（最终质量浓度约为0.01 ppm）作为内标物，然后将老化后的萃取头通过密封垫插入样品瓶，顶空吸附60 min。每个比例样品各取3个平行。

1.4.4 挥发性风味物质的测定

色谱条件∶起始温度40℃，保持3 min，以4℃/min升温速率升至140℃，保持1 min，以10℃/min升温到250℃，保持3 min；汽化室温度为250℃；载气为He，流速1.0 mL/min；不分流进样。

质谱条件∶EI离子源，电子能量70 eV；离子源温度230℃；质量扫描范围（m/z）33～450 AMU；发射电流100 μA。

萃取条件∶平衡温度为50℃，平衡时间为60 min。

解吸附条件∶250℃条件下解吸附3 min。

1.4.5 定性与定量分析

利用随机携带Masshunter工作站NIST 1.1标准库自动检索各组分质谱数据结果，采用以上相同的程序升温条件，用C3～C20正构烷烃作为标准，根据保留时间计算样品中检测的化合物的保留指数（reten⁃tion index，RI），同时结合相似度并参考相关文献色谱保留指数[6-9]共同定性，确定出相应的挥发性风味物质种类。采用各成分峰面积与内标物峰面积对比进行半定量分析，计算公式为

2 结果与分析

应用SPME-GC-MS法分析不同比例（1∶10、1∶100和1∶1000）保加利亚乳杆菌IMAU20240和嗜热链球菌IMAU40040的复配发酵乳中挥发性风味物质，在贮藏12 h时的分离情况见图1，测定结果如表1～表5所示。

图1 贮藏12 h时挥发性风味化合物的总离子图

2.1 酸类化合物的比较分析

酸类化合物一般是通过脂肪分解和微生物发酵产生的[3]。由表1可知，贮藏12 h时三种比例复配组的发酵乳中检出的酸类化合物的种类和含量出现显著差异。3种比例复配组的发酵乳中检出的共有的酸类化合物有4种，分别为戊酸、3-甲基丁酸、己酸、辛酸，且各复配组中各组分含量有明显差异，其中，1∶100复配组中各组分含量高于其他复配组，分别为4.57，174.37，18.39，12.95（×10-6）。除上述共有化合物外，各复配组发酵乳中还检出一些独有成分，如1∶10复配组发酵乳中检出丙基丙二酸、2-甲基己酸，1∶100复配组发酵乳中检出丁酸、n-癸酸，1∶1000复配组发酵乳中检出2-甲基丙酸。通过分析3组复配组发酵乳中的风味物质，发现1∶100复配组发酵乳中检出的酸类化合物的种类和含量明显高于其他复配组，如乙酸、己酸的含量分别为20.24、18.39 ppm，远高壬酮，且含量较低。一些研究者认为2，3-丁二酮是发酵乳风味形成的关键成分[15]，可以赋予发酵乳浓郁的奶油香味[16]。本实验在贮藏12 h时三个复配组均未检出2，3-丁二酮，这可能由于2，3-丁二酮在3-羟基-2-丁酮还原酶的作用下发生不可逆反应代谢为3-羟基-2-丁酮（乙偶姻）。乙偶姻是许多乳制品中常见的风味物质，能赋予发酵乳弱奶油香味[3]。由表2可以看出，在贮藏12 h时三个复配组发酵乳中均检出于其他比例的复配组。乙酸、己酸等挥发性酸能增加发酵乳的酸味[10]，在其他研究中也发现了类似的结果[11]。综上所述，当保加利亚乳杆菌IMAU20240和嗜热链球菌IMAU40040的添加比例为1∶100时，发酵乳中检出的酸类化合物的种类和含量显著优于其他比例的复配组。

表1 贮藏期间酸类化合物的鉴定结果

2.2 酮类化合物的比较分析

酮类化合物主要是由不饱和脂肪酸的氧化或热降解、氨基酸降解或微生物代谢所产生[12-13]。本实验在贮藏12 h时三个复配组共检出7种酮类物质，包括3-甲基-2-丁酮、乙偶姻、2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮、5-甲基-3-庚酮及2-十一酮。这些化合物均在复配组1∶10和1∶100中被检出，而在复配组1∶1000的发酵乳中只检测出3-甲基-2-丁酮、乙偶姻、2-戊酮、2-乙偶姻，且1∶100复配组中其含量为74.33×10-6，明显高于其他复配组。此外，由辛酸的β氧化和癸酸的脱羧反应得到的2-庚酮、2-壬酮两个甲基酮[17]均在复配组1∶10和1∶100中检出，而在复配组1∶1000的发酵乳中只检出2-壬酮，这些化合物可赋予发酵乳水果味、奶香味，对发酵乳风味的构成具有重要意义[4]。针对不同比例复配组发酵乳风味差异性的研究发现，复配组1∶100发酵乳中的酮类化合物的种类和含量显著高于其他比例的复配组。

2.3 醇类化合物的比较分析

醇类化合物一般是由脂肪酸衍生而来或羰基化合物还原而来[18-19]。由表3可知，贮藏12 h时从三个比例的复配组发酵乳中共检出12种醇类化合物，且各复配组中醇类化合物的种类和含量明显不同。其中，复配组1∶10、1∶100、1∶1000发酵乳中分别检出10、8、3种醇类化合物。在上述不同比例复配发酵乳中检出

的共有醇类化合物有3-甲基-1-丁醇、1-庚醇和1-辛醇，且各复配组中的含量出现明显差异。其中，复配组1∶100发酵乳中共有醇类化合物的含量远高于其他复配组，分别为13.49，17.17，14.43（×10-6）。除上述共有醇类化合物外，各复配组发酵乳中还检出一些独有成分，如1∶10复配组发酵乳中检出4-甲基环己醇、反-1，2-环戊二醇、反式-2-辛烯-1-醇、2，7-二甲基正辛醇，1∶100复配组发酵乳中检出3-甲基甲酸丁醇，1-己醇，而在1∶1000复配组发酵乳中没有检出独有化合物。大多醇类化合物的风味阈值较高，因此认为这类化合物对发酵乳的风味影响贡献不大[20]。

表2 贮藏期间酮类化合物的鉴定结果

表3 贮藏期间醇类化合物的鉴定结果

2.4 醛类化合物的比较分析

醛类化合物的阈值较低，对发酵乳风味的形成贡献较大[21]。本实验中检出7种醛类化合物，其中1∶1000复配组发酵乳中仅检出3-甲基丁醛和3-羟基丁醛，而这两种物质在复配组1∶100和1∶10发酵乳中均有检出，且复配组1∶100发酵乳中含量相对较高。此外，复配组1∶10和1∶100的发酵乳中还检出其他多种醛类化合物，包括乙醛、庚醛、反-2-辛烯醛、己醛及2-甲基丙醛等。其中，乙醛是发酵乳中重要的风味化合物[22]，纯乙醛具有辛辣刺激性的气味，但适量浓度的乙醛不仅能平衡发酵乳风味而且能赋予产品良好的风味[23]。一般认为具有典型风味发酵乳中乙醛含量为10～15×10-6，而高品质发酵乳中的乙醛含量要高于31.27×10-6。由表4中可以看出，贮藏12 h时，复配组1∶10、1∶100发酵乳中检出的乙醛含量分别为6.83和34.56×10-6ppm，而在1∶1000复配发酵乳中没有检测到乙醛，说明复配组1∶100发酵乳的风味要优于其他复配组。除乙醛外，其他醛类化合物的存在也对发酵乳的风味产生影响，如己醛作为亚油酸的主要氧化产物[24]，可对发酵乳整体风味产生重要影响[25]。

2.5 酯类化合物的比较分析

发酵乳中的酯类物质大多是分子量较小的酸类物质和醇类物质发生酯化反应或环化反应生成的低级脂肪酸化酯及内酯[26]。大多数的酯类化合物的阈值较低，具有果香味或坚果仁味，可以降低脂肪酸和胺类物质带来的苦涩味[27]。本实验在贮藏12 h时共检出4种酯类物质，包括甲酸乙烯酯、硝酸正戊酯、乙酰乙酸壬酯及2-乙基丁酸烯丙酯，其中甲酸乙烯酯在三个复配组（1∶10、1∶100、1∶1000）发酵乳中均有检出，其含量分别为7.90、39.14和28.14×10-6。其余酯类化合物只在复配组1∶10发酵乳中被检出，且含量较低，对发酵乳的整体风味影响较低。

表4 贮藏期间醛类化合物的鉴定结果

表5 贮藏期间酯类化合物的鉴定结果

3 结论

本实验将保加利亚乳杆菌IMAU20240和嗜热链球菌IMAU40040以不同比例（1∶10，1∶100和1∶1000）复配，采用1，2-二氯苯作为内标，利用固相微萃取前处理方法，结合气相色谱-质谱联用技术分析发酵乳中挥发性风味物质。结果表明，各比例复配组发酵乳中的挥发性风味物主要由酸类、醇类、酮类、醛类以及酯类等化合物组成；且三个复配组发酵乳在贮藏期间主要的挥发性风味化合物的种类和含量存在明显差异，其中，复配组1∶100的发酵乳中主要的挥发性风味化合物有乙酸、乙偶姻、乙醛、己醇、甲酸乙烯酯及3-甲基-1-丁醇等，且含量高于其他复配组发酵乳，说明保加利亚乳杆菌IMAU20240和嗜热链球菌IMAU40040活菌数的比例为1∶100时，其发酵乳的风味优于其他组合。

∶

[1]ELIK E S.Determination of aroma compounds and exopolysaccha⁃rides formation by lactic acid bacteria isolated from traditional yogurts [D].zmir Institute of Technology，2007.

[2]TAMIME AY.Fermented milks∶a historical food with modern appli⁃cations——a review[J].European Journal of Clinical Nutrition，2002，56 suppl 4（12）∶S2.

[3]CHENG H.Volatile flavor compounds in yogurt∶a review[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2010，50（10）∶938-950.

[4]GALLARDO-ESCAMILLA FJ，KELLY AL，DELAHUNTY CM. Influence of starter culture on flavor and headspace volatile profiles of fermented whey and whey produced from fermented milk[J].Journal of Dairy Science，2005，88（11）∶3745-3753.

[5]王伟君，李延华，张兰威，等.SDE-GC-MS法测定发酵乳中风味物质[J].食品科学，2008，29（6）∶332-334.

[6]GILLES F，PATRICK C，JEAN‐CLAUDE C，BERNARD P.Stud⁃ies of Mediterranean oregano populations.VIII—Chemical composi⁃tion of essential oils of oreganos of various origins[J].Journal of Essen⁃tial Oil Research，2006，18（3）∶250-252.

[7]MILDNER-SZKUDLARZ S，JELEN HH.The potential of different techniques for volatile compounds analysis coupled with PCA for the detection of the adulteration of olive oil with hazelnut oil[J].Food Chemistry，2008，110（3）∶751-761.

[8]RIUAUMATELL M，LOPEZTAMAMES E，BUXADERAS S.As⁃sessment of the volatile composition of juices of apricot，peach，and pear according to two pectolytic treatments[J].Journal of Agricultural &Food Chemistry，2005，53（20）∶7837-7843.

[9]VENTANAS S，ESTEVEZ M，ANDRES AI，RUIZ J.Analysis of vol⁃atile compounds of Iberian dry-cured loins with different intramuscu⁃lar fat contents using SPME–DED[J].Meat Science，2008，79（1）∶172-180.

[10]SINGH TK，DRAKE MA，CADWALLADER KR.Flavor of Ched⁃dar Cheese∶A Chemical and Sensory Perspective[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2003，2（4）∶166-189.

[11]吴均，赵晓娟，陈佳昕，杜木英，阚建全.西藏、川西青藏高原牧区自然发酵牦牛酸奶中优良乳酸菌的筛选及鉴定[J].食品科学，2013，34（17）∶150-155.

[12]CHIOFALO B，ZUMBO A，COSTA R，LIOTTA L，MONDELLO L，DUGO P，CHIOFALO V.Characterization of Maltese goat milk cheese flavour using SPME-GC/MS[J].South AfricanJournal of Ani⁃mal Science，2004，34（1）∶176-180.

[13]郭本恒.干酪[M].化学工业出版社，2004.

[14]范文来，徐岩，李记明，尹建邦，于英.应用GC-O和GC-MS研究蛇龙珠葡萄酒游离态挥发性香气成分[J].食品与发酵工业，2011，37（11）∶183-188.

[15]VEDAMUTHU E R.Starter cultures for yogurt and fermented milks [J].Manufacturing yogurt and fermented milks，2006∶89

[16]STLIE H M，HELLAND MH，NARVHUS JA.Growth and metabo⁃lism of selected strains of probiotic bacteria in milk[J].International Journal of Food Microbiology，2003，87（1-2）∶17-27.

[17]MCSWEENEY PLH，SOUSA MJ.Biochemical pathways for the production of flavour compounds in cheeses during ripening∶A re⁃view[J].Le Lait，2000，80（3）∶293-324.

[18]CHAVES AC，FERNANDEZ M，LERAYER AL，MIERAU I，KLEEREBEZEM M，HUGENHOLTZ J.Metabolic engineering of acetaldehyde production by Streptococcus thermophilus[J].Applied &Environmental Microbiology，2002，68（11）∶5656-5662.

[19]刘玉平，陈海涛，孙宝国.鱼肉中挥发性成分提取与分析的研究进展[J].食品科学，2009，30（23）∶447-451.

[20]张国农，顾敏锋，李彦荣，卢蓉蓉.SPME—GC/MS测定再制干酪中的风味物质[J].中国乳品工业，2006，34（9）∶52-56.

[21]衣宇佳，田怀香，郑小平，汤坚.同时蒸馏萃取和固相微萃取法提取国产干酪中风味物质[J].食品与机械，2008，24（2）∶70-74.

[22]POURAHMAD R，ASSADI MM.Yoghurt production by Iranian native starter cultures[J].Nutrition&Food Science，2005，35（6）∶410-415.

[23]赵建新，陈洁，田丰伟，陈卫，张灏.中温发酵酸乳的挥发性风味成分与感官特性的研究[J].食品工业科技，2008（12）∶69-73.

[24]XIE J，SUN B，ZHENG F，WANG S.Volatile flavor constituents in roasted pork of Mini-pig[J].Food Chemistry，2008，109（3）∶506-514.

[25]王学敬，李聪，王玉峰，王赟，张万刚，徐宝才.SPME-GC-MS法分析德州扒鸡挥发性风味成分的条件优化及成分分析[J].南京农业大学学报，2016，39（3）∶495-501.

[26]FARES K，LANDY P，GUILARD R，VOILLEY A.Physicochemi⁃cal Interactions Between Aroma Compounds and Milk Proteins∶Ef⁃fect of Water and Protein Modification[J].Journal of Dairy Science，1998，81（1）∶82-91.

[27]ZEHRA G.Changes in salted yoghurt during storage[J].Internation⁃al Journal of Food Science&Technology，2007，42（2）∶235-245.

Analysis of fermented milk flavor in mixed fermentation of different strains with various proportions by SPME-GC-MS

JIN Rulin，WU Shimei，REN Weiyi，DAN Tong，SUN Tiansong
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural Universi⁃ty，Hohhot 010018，China）

∶The effects ofLactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricusandStreptococcus thermophiluswith different proportions on the fer⁃mented milk flavor were studied.The volatile flavor compounds of fermented milkby starters ofLactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus IMAU20240 andStreptococcus thermophilusIMAU40040 in three different ratios（1∶10，1∶100 and 1∶1000）were detected using solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry（SPME-GC-MS）technique，and internal standard method.The results showed that the main volatile flavor compounds in all of fermented milk groups were composed by acids，alcohols，ketones，aldehydes and es⁃ters.But the types and quantities of main flavor compounds were significantly different during storage.Among them，the fermented milk group in a ratio of 1∶100 had acetic acid，acetoin，acetaldehyde，hexyl alcohol，vinyl formate and 3-methyl-1-butanol and their content were higher than the other groups，so two strains in the ratios 1∶100 was considered as the ideal combination.

∶fermented milk；volatile flavor compounds；solid phase microextraction（SPME）；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

Q93-33

：A

：1001-2230（2017）06-0009-06

2016-12-10

国家自然科学基金项目（31471711；31460446）。

靳汝霖（1992-），女，硕士研究生，研究方向为乳品生物技术与工程。

孙天松