保幼激素和蜕皮激素对家蚕翅原基生长分化的影响

胡启豪, 刘学术, 马 琼, 冯启理, 邓惠敏

(华南师范大学生命科学学院，广州市昆虫发育调控与应用重点实验室， 广州 510631)

保幼激素和蜕皮激素对家蚕翅原基生长分化的影响

胡启豪, 刘学术, 马 琼, 冯启理, 邓惠敏*

(华南师范大学生命科学学院，广州市昆虫发育调控与应用重点实验室， 广州 510631)

文中以家蚕翅原基为材料，通过制做离体石蜡切片的方法观察了翅原基从五龄幼虫第3天至蛹期0天的形态变化，并通过注射外源蜕皮激素活性物质20E和保幼激素类似物Methoprene探究了昆虫激素对家蚕翅原基生长分化的影响. 结果显示，翅原基在幼虫阶段发育缓慢，从五龄幼虫第6天起生长分化逐渐加快，且翅原基的形态发生了显著变化，原本附着于翅原基腔口处且呈团状的造血器官逐渐分散至消失，而由气管组成的翅脉逐渐形成. 外源激素处理结果显示，2 μg的20E可促进翅原基的生长分化，而2 μg 的Methoprene抑制了翅原基的生长分化. 上述结果说明蜕皮激素和保幼激素共同调控了翅原基的生长分化，并最终实现了翅原基的变态发育.

家蚕； 翅原基； 生长分化； 蜕皮激素； 保幼激素

完全变态昆虫一生经历了卵、幼虫、蛹及成虫的过程. 其中，昆虫的蜕皮和变态的过程由体内保幼激素(Juvenile Hormone, JH)和蜕皮激素(Ecdysteroids, Ecd) 共同调控，目前已发现至少存在7种天然的JH，其中JHⅢ是所有昆虫中都存在的JH类型，此外，也发现蜕皮激素的活性成分为20-羟基蜕皮酮(20-Hydroxyecdysone，20E). 昆虫变态发育的机制是当今的研究热点. 家蚕(B.mori)为鳞翅目模式昆虫，且蚕丝用于丝绸生产，因此研究家蚕变态发育的机理有着重要的经济价值和理论意义.

翅原基是完全变态昆虫的成虫盘之一，位于家蚕的第2和第3胸节的左右两侧，前一对翅原基较大，呈三角形，后一对翅原基较小，呈圆形，分别发育成成虫的前后翅[1]. 在翅原基生长分化过程中，一系列基因的时空特异性表达起着关键性作用[2]. 研究显示，家蚕翅原基在四龄幼虫末期和五龄幼虫初期对保幼激素的敏感性降低，且随着JH的减少，20E起主要作用，翅原基逐渐向成虫翅发育分化[3-4]. 在烟草天蛾中，当JH存在时，翅原基的生长分化会被暂时抑制[5]，而在化蛹阶段，由于JH浓度的下降，翅原基可以继续生长分化[6]. 此外，FRISTROM等[7]发现在体外培养的条件下，20E能够诱导成虫盘的分化. 因此，翅原基的发育可能受到JH和20E的共同调控.

为了进一步探究家蚕翅原基在发育过程中的形态变化及激素对其的调控，我们通过分离翅原基并制作石蜡切片，对五龄幼虫第3天至蛹期0天家蚕翅原基的生长分化进行观察，利用HPLC测定不同发育时期内源激素的变化情况，并通过注射外源激素，进一步分析激素对家蚕翅原基发育的影响. 该研究可为进一步探究昆虫翅发育的分子机理提供理论依据和思路.

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

所用的家蚕(B.mori)品种为大造，蚕卵由广东省蚕业研究所提供. 幼虫在温度(26±1) ℃，相对湿度65%～75%，光周期12 h∶12 h (光∶暗)的培养箱中用新鲜采摘的桑叶(采摘自华南农业大学蚕学桑园实习基地)饲养.

蜕皮激素活性物质(20-Hydroxyecdysone，20E)和JH类似物(正法呢烯酸甲酯,Methoprene)均购自Sigma 公司. 磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Saline,PBS).

1.2 家蚕翅原基的分离及观察

分别将五龄幼虫第3天至蛹期0天的家蚕置于冰上冷冻休克，然后在装有PBS的蜡盘里解剖. 从第2和第3胸节处分离出翅原基. 于解剖镜下观察其形态结构.

1.3 离体家蚕翅原基石蜡切片制作

五龄幼虫第3天至第6天的家蚕按上述方法分离翅原基并放入4%多聚甲醛固定. 将上簇1天至蛹期0天的家蚕置于冰上冻至休克，于头部注射4%多聚甲醛固定液，放入4%多聚甲醛固定1 h后截取第2和3胸节，再放进4%多聚甲醇固定过夜. 将上述样品用PBS洗3次，每次5 min. 然后分别用50%、70%、85%、95%及100%的乙醇脱水，每次1 h，再用100%二甲苯透明. 将上述处理的翅原基组织观察样本于60 ℃ 石蜡中渗蜡2 h. 将熔化的石蜡与组织放进包埋架，调整好位置，待石蜡凝固后放进4 ℃冷却. 取出蜡块于切片机切片.

1.4 石蜡切片苏木精-伊红(H.E)染色

将上述切片于二甲苯中脱蜡2次，每次5 min. 再移入二甲苯和纯酒精(1∶1)混合液中洗涤5 min. 将样品分别置于100%、95%、90%、80%、70%及50%酒精中复水5 min. 苏木精染液染色15 min. 1%盐酸酒精分色. 将分色后样品置于1%氨水中蓝化，使细胞核呈蓝色. 蒸馏水短洗，0.5%伊红染液染色1 min. 依次经70%、80%、90%、95%及100%酒精脱水5 min. 将样品置于二甲苯和纯酒精体积比为1∶1的混合液中洗涤5 min. 再于二甲苯透明2次，每次5 min. 去除多余的二甲苯，滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固. 于倒置显微镜下观察.

1.5 HPLC测定血淋巴中的20E和JHⅢ浓度

选取不同发育时期的家蚕，用解剖剪剪开虫体的末端腹足，让血淋巴液渗出，用离心管收集，12 000 r/min离心5 min，去除细胞碎片和其他杂质，所有操作均在冰上进行. 每个时期取材3份，参考钱明惠等方法[8]提取20E和JHⅢ由于JHⅢ在所有昆虫中都普遍存在，因此，本研究主要测定JHⅢ的含量，并利用反相HPLC方法测定其浓度. 实验重复3次.

1.6 昆虫激素对翅原基生长分化的影响

选取五龄幼虫第4天，生长状况基本一致的家蚕幼虫，在其第2与第3胸节处分别注射4 μL不同质量浓度的JH类似物Methoprene和蜕皮激素活性物质20E(质量浓度分别为0.5 μg/μL和1.0 μg/μL)，以注射等量0.1%DMSO 作为空白对照组. 于注射后48 h和96 h后取出翅原基，观察翅原基形态和大小变化，计算和统计翅原基面积. 每条蚕都有2对翅原基，为减少计算误差，在分离翅原基时，均取前一对翅原基. 每个时间点和浓度6个重复，实验重复3次. 应用Graphpad Prism 5统计分析软件，采用ANOVA(多个处理间的两两比较)或t检测(两个样品间比较)进行差异性分析.

2 结果与分析

2.1 家蚕五龄幼虫翅原基和蛹期翅芽形态的变化

为观察家蚕翅原基在发育过程中的形态变化，首先对不同发育时期的翅原基进行观察. 结果显示五龄幼虫第3天(L5D3，图1A)、五龄幼虫第4天(L5D4，图1B)、五龄幼虫第5天(L5D5，图1C)、五龄幼虫第6天(L5D6，图1D)、游走期第1天(WD1，图1E)及游走期第2天(WD2，图1F)翅原基的形态和面积变化不大，生长相对缓慢；预蛹期(PP，图1G)和蛹期第0天(PD0，图1H)的翅原基面积明显增大，生长相对较快. 此外，从五龄幼虫第6天(L5D6，图1D)开始，翅原基的形态发生了显著的变化. 原本附着于翅原基腔口处，呈团状的造血器官逐渐分散至消失，气管组成的翅脉开始逐渐形成(图1D～G). 预蛹期的翅牙被保护在表皮下面，翅脉已经硬化，出现了鳞毛和花纹(图1H). 翅原基在幼虫期的大小和形态都未发生明显的变化，但在预蛹期，其大小和形态都发生了显著的改变. 而昆虫的变态发育主要受到体内JH和20E的协同调控，因此昆虫激素可能参与了翅原基的生长分化.

A：L5D3；B：L5D4；C：L5D5；D：L5D6；E：WD1；F：WD2；G：PP ； H：P0;L：幼虫龄期；D：天；W：游走期； PP ：预蛹期；P：蛹期

2.2 翅原基发育过程的切片观察

为进一步研究家蚕翅原基的发育过程，将五龄幼虫第3天(L5D3，图2A)、五龄幼虫第4天(L5D4，图2B)、五龄幼虫第5天(L5D5，图2C)和五龄幼虫第6天(L5D6，图2D)的翅原基制作成石蜡切片进行观察. 由于家蚕进入游走期后，翅原基组织会发生外翻等事件，为了不破坏翅原基各组织部位的相对位置变化并使正在消失的翅囊能够显示出来，对游走期及之后的时期采用整虫切片法观察翅原基组织结构(图2E～H). 结果显示，五龄幼虫第3天至第6天翅原基的翅囊包裹在翅芽外周，翅芽是该时期翅原基的主要部分. 翅芽中的空隙称作翅腔，气管位于翅腔中. 这段时期内翅原基处除体积稍有变大外，其形态结构和各组织相对位置没有较大的变化. 到了游走期第0天(WD0,图2E)、游走期第1天(WD1，图2F)、游走期第2天(WD2，图2G)和蛹期0天(PD0，图2H)，除了面积显著增大外，翅原基细胞团逐渐展开，形成成型的蛹翅. 这时候包被翅芽的翅囊逐渐消失，其中的造血器官也逐渐消失. 这表示在进入游走期后，尤其是在游走期第1天(WD1，图2F)和游走期第2天(WD2，图2G)，翅囊和造血器官等部位很可能发生细胞死亡事件，导致翅原基该部分结构退化. 翅原基在这段时期发生显著变化，进一步说明其发育可能受昆虫激素的调控.

2.3 家蚕不同发育时期血淋巴中20E和JHⅢ的含量

通过观察翅原基在不同时期的生长状况，发现家蚕翅原基的生长分化可能受到JH和20E的调控. 结果显示，20E含量在五龄幼虫期较低，在游走期(W期)至吐丝期(S期)第2天(S36H)含量升高. 其中，20E含量进入游走期(W0H)出现小峰，该峰的作用可能为启动化蛹[9]；在吐丝36 h(S36H)左右20E含量达到高峰，该峰的作用可能引起蜕皮化蛹；在蛹期第2天(PD2)又出现一个高峰，该峰可能启动蛹期向成虫的转变. 20E含量的变化趋势与翅原基生长分化趋势是相近. JHⅢ在五龄第1天(L5D5)的含量较高，从五龄幼虫第2天(L5D2)至第6天(L5D6)之间JHⅢ含量逐步降低，进入游走期(W期)后JHⅢ开始稍微上升，到吐丝第2天(S48H)JHⅢ水平达到最高，随后降低(图3). 由此，我们推测，在五龄幼虫初期高含量的JHⅢ 抑制翅原基发育，使翅原基维持幼虫状态；在五龄幼虫末期，JHⅢ 含量降低，同时20E含量升高，翅原基迅速进行生长分化.

A：L5D3；B：L5D4；C：L5D5；D：L5D6；E：WD0；F：WD1；G：WD2；H：PD0;L：幼虫龄期；D：天；W：游走期；P：蛹期

L：幼虫龄期；D：天；W：游走期；S ：吐丝期；P：蛹期

2.4 蜕皮和保幼激素对翅原基生长分化的影响

为进一步探究激素是否调控翅原基的生长分化，对五龄幼虫第4天的家蚕分别注射2 μg和4 μg JH类似物Methoprene与20E，并以等量的0.1%DMSO为对照，于注射后48 h和96 h分离翅原基，观察翅原基的形态和面积变化，并对翅面积进行统计分析，结果显示，与对照(图4A,F和图5A)相比，2 μg 的JH类似物Methoprene处理48 h和96 h后的翅原基面积显著变小(图4B,J和图5A)，而2 μg的20E处理后的翅原基面积显著增大，且翅脉分化显著(图4D,I和图5A)，这表示JH可抑制翅原基的生长分化，而20E则对翅原基的生长分化起促进作用. 但4 μg的Methoprene或20E处理对翅原基形态和面积的影响没有2 μg处理的效果明显(图4和图5B)，这表示了JH和20E可调控翅原基的生长分化，但具有最佳使用剂量.

3 讨论

翅原基是昆虫体内成虫原基的一种，经生长发育后最终形成成虫的翅. 翅原基发育分化与昆虫个体生长发育紧密联系，研究翅原基的发育有助阐述昆虫的个体发育过程.

本文通过观察翅原基在不同时期的形态发现，家蚕翅原基在五龄幼虫初期生长缓慢，在五龄末期开始迅速生长. 此外，从五龄幼虫第6天开始，翅原基造血器官逐渐消失并开始形成翅脉. 家蚕造血器官在蚕体的保卫作用和损伤修复中起关键作用，且在变态过程中可分解不需要的组织和器官[10]. 张健等[11]发现，翅原基造血细胞在五龄初期有大量增加，其作用可能是消除不需要的幼虫组织细胞. 因此作者推测，在变态发育阶段，造血器官完成自身功能后，开始退化，为形成翅脉等成虫所需的组织做准备.

激素处理家蚕实验发现，JH可抑制翅原基的生长分化，而20E可促进翅原基的生长分化. 有研究显示，在家蚕幼虫期用JH或JH类似物Methoprene处理，可引起幼虫额外蜕皮而产生超龄幼虫[12]，在赤拟谷盗中也有相似的情况[13]. 因此，作者推测在幼虫中，高质量浓度的JH抑制了翅原基的生长分化，使其维持幼虫状态，到了幼虫末期，JH质量浓度下降，高质量浓度的20E促进翅原基发育，有助于变态过程的完成.

JH和20E对翅原基发育的调控通过一个复杂而系统的调控网络进行的. DENG等[14-15]发现，翅原基表皮蛋白基因BmWCP4主要在预蛹和蛹中期的表皮中表达，是翅原基生长分化的关键因子，20E通过诱导转录因子BmPOUM2与BmFTZ-F1的表达进而激活了BmWCP4的表达，而JH则可抑制该过程的发生. 但是，JH和20E对翅原基发育的精细调控，仍需进一步的研究.

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【中文责编：成文 编辑助理：冷佳奕 英文审校：李海航】

Effects of Javenile Hormone and Ecdystuoids on the Development of Wing Disc in Silkworm,Bombyxmori

HU Qihao， LIU Xueshu, MA Qiong， FENG Qili， DENG Huimin*

(Guangzhou Key Laboratory of Development Regulation and Application Research of Insects, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

The morphology of wing discs from day 3 of 5thlarval instar to day 0 of pupa was observed by separated wing disc and the paraffin sections. To determine whether the growth and differentiation of wing discs were regulated by insect hormone,ecdysone 20E and juvenile hormone analogue Methoprene were injected into the silkworm at day 3 of 5thlarval instar separately. The results showed that the wing discs grew slowly at larval stage but grew quickly from day 6 of 5thlarval instar. What’s more, the morphology and structure of wing discs changed significantly. The hematopoietic organ degraded gradually and the veins formed finally. The development and differentiation of the wing discs were positively regulated by the certain dose of 20E and negatively regulated by Methoprene. The above results indicated that ecdysone and juvenile hormone regulated the growth and differentiation of wing discs, resulted in the metamorphosis of wing discs.

Bombyxmori; wing disc; growth and differentiation; ecdysone; juvenile hormone

2016-05-12 《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

国家自然科学基金项目(31330071，31301918)

K826.15

A

1000-5463(2017)04-0062-06

*通讯作者:邓惠敏，副教授，Email：denghuiminmin@163.com.