缺血性脑卒中患者恢复稳定期外周血单个核细胞中差异表达基因的生物信息学研究

彭彬 张雪 曹帆帆 王莹 孙家兰 江梅 李龙宣

缺血性脑卒中患者恢复稳定期外周血单个核细胞中差异表达基因的生物信息学研究

彭彬 张雪 曹帆帆 王莹 孙家兰 江梅 李龙宣

目的分析缺血性脑卒中(IS)患者恢复稳定期外周血单个核细胞(PBMCs)中的差异表达基因，为探讨脑卒中恢复稳定期的遗传病理机制提供生物信息学线索。方法选择GEO数据库中GDS4521芯片数据，该芯片以年龄、性别相匹配的20例IS恢复稳定期(脑卒中发生至少6个月以上)患者和20例未发生过脑卒中者作为研究对象，收集其PBMCs进行基因芯片检测，利用GEO2R、DAVID、g:profiler和String等工具，筛选和分析差异表达基因功能富集和相关信号通路情况。结果脑卒中恢复稳定期组与对照组相比，在PBMCs中发现37个基因表达明显变化，其中34个上升，3个下降。GO分析表明，这些差异表达基因在生物过程方面，以炎性反应、中性粒细胞趋化相关基因为最多；在分子功能方面，以趋化因子活性相关基因为最多。KEGG信号通路分析表明，位于TNF信号通路中的差异表达基因数量最多。相互作用网络图揭示，这些差异基因主要以与炎性反应相关的两个网络为主。结论IS发生超过6个月后仍有多种功能蛋白和信号通路可能发生改变，特别是与炎性反应相关的蛋白和信号通路，提示炎性反应在IS的恢复稳定期仍可能对疾病的预后和再发起作用。

缺血性卒中；生物信息学；基因芯片；差异表达基因

脑卒中在全球范围死亡率位列第二[1]。我国脑卒中发病率一直居高不下，成为威胁我国国民生命健康的第一位死因。脑卒中是一种复杂性疾病，由多种环境和遗传等危险因素共同作用导致[2]，分为缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)和出血性脑卒中，其中IS占大多数[3]。目前，对IS，特别是恢复稳定期的分子变化研究十分有限，寻找该阶段易感基因对更好地了解IS恢复和复发机制有重要意义。生物芯片技术的应用，为了解脑卒中发生发展过程中多种组织器官中基因和蛋白的变化提供了便利，为研究脑卒中的发病机制提供了数以百计的候选分子。本研究通过分析基因芯片公共数据库(gene expression omnibus，GEO)中IS恢复稳定期患者PBMCs芯片数据，利用多种数据分析技术，对该芯片进行生物信息学发掘，探索IS恢复稳定期中蛋白的表达和涉及信号通路情况。

1 材料和方法

1.1芯片数据的选择利用NCBI中GEO芯片数据库对目标芯片进行搜索[4]，搜索词为“stroke，homo”。经筛选后，采用由Krug等提交的芯片数据(GDS4521)[2]，该芯片以Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array为平台，收集20例首次发生或仅发生IS至少6个月后患者的外周血单个核细胞(PBMCs)，其中男10例，女10例，平均年龄(60.2±10.6)岁。以20例未发生脑卒中者作为对照，其中男10例，女10例，平均年龄(58.7±11.0)岁，排除存在脑卒中家族史且严重贫血和活动性过敏反应者。两组间性别构成、年龄，合并高血压、高胆固醇血症、糖尿病等基础疾病以及抽烟、喝酒等生活习惯比较无统计学差异。

1.2方法GEO2R是一种网络交互工具，能对GEO数据库中的两组及以上组别基因芯片数据样本进行分析，得到在某种实验条件下差异表达的基因情况。利用GEO2R在线分析工具，比较分析IS发病6个月以上患者与对照组PBMCs基因表达，寻找差异表达基因。

DAVID、g:profiler等是生物信息学分析中常用的在线分析工具，能对大量基因进行基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析、KEGG信号通路分析、功能注释等。利用这两种工具，对筛选出的差异表达基因进行基因功能注释、富集分析和信号通路分析。String数据库(String 10.0)是用来预测蛋白质间功能相关性的在线分析工具，利用这一工具对找到的差异表达基因进行与它们相互作用蛋白的预测分析。

2 结果

2.1两组PBMCs蛋白表达变化采集GEO数据库中GDS4521芯片数据，通过GEO2R分析，对比IS患者与对照组PBMCs的基因表达情况，以value means difference在正负相差2倍以上为标准，得到53种差异表达基因，去除重复、无gene ID等基因后，最终筛选出37种差异表达基因，其中34种在IS发生后超过6个月的恢复稳定期中表达上调，3种(EIF5A、HLA-DQA1、TNFRSF17)表达下调。37种差异表达基因热图见图1。

2.2差异表达基因功能富集和信号通路分析对筛选出的差异表达基因进行GO分析发现，在生物过程方面，差异表达基因共分为51类，包含5个基因以上的类别为9类，主要集中在炎性反应和免疫反应、趋化作用、细胞增殖凋亡等；在细胞组成方面，差异表达基因主要分布在胞浆、细胞外间隙；在分子功能方面，差异表达基因共分为6类，主要集中在趋化因子活性及受体结合、转录因子活性、细胞因子活性等，以趋化因子活性相关基因为最多(图2)。KEGG信号通路分析表明，差异表达基因主要分布在肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核转录因子κB(NF-κB)、趋化因子、TOLL样受体(Toll-like receptor)、NOD样受体等通路，其中在TNF-α信号通路中的相关基因最多(图3)。具体结果见表1。

2.3差异表达基因相互作用分析除没有预测到具有相互作用的9个蛋白外，其余差异蛋白之间主要构成了2大网络，分别以TNF和JUN两个基因为中心。结果见图4。

注：IS：缺血性脑卒中，图2～4、表1同；PBMCs：外周血单个核细胞；差异基因表达量从高到低分别以红色至蓝色表示，热图左侧为基因名称，上方为样本编号(其中IS为缺血性脑卒中组，Con为对照组)，右侧树状结构代表样本之间的相似度聚类关系图1 IS患者恢复稳定期与对照组PBMCs差异表达基因热图(HemI 1.0软件绘制)

图2 IS组和对照组差异表达基因GO分析结果

3 讨论

脑卒中复发率很高，发病后2年内，25%的患者会在恢复期阶段再发脑梗死或其他血管事件，但目前对脑卒中恢复期，特别是卒中发生后半年以上恢复稳定期的分子病理研究有限，且既往关于脑卒中患者PBMCs表达谱的研究多集中在急性期或缓解期。有研究表明，脑卒中后神经和功能恢复在发病6个月后到达平台期，因此6个月被认为是使PBMCs回到其“静息”表达谱状态充分的时间窗，更能反映个体易于罹患脑卒中的遗传因素[5-7]。本研究通过对IS恢复稳定期(首发IS 6个月以上)患者PBMCs生物芯片数据进行分析，筛选出与IS恢复稳定期密切相关的多种蛋白和相关信号通路。

3.1IS发病后6个月PBMCs仍存在多种表达明显异常蛋白GEO数据集组(GEO Data Sets，GDS)是GEO数据库将用户提供的样本数据整理后，集中归纳到有生物统计学意义的数据集合，可提供一个实验的相关概况，以便进行下游数据挖掘。为便于寻找差异表达基因，GEO还同时提供了在线数据分析工具GEO2R[8]。该工具基于R语言中Bioconductor包，对数据进行分析，是筛选芯片数据中差异表达基因的有利工具。本研究运用GEO2R分析，发现GDS4521芯片数据中37种差异表达基因，其中34种在IS发生超过6个月后，与对照组相比明显上调，3种下调。GDS4521芯片所收集的样本为IS首发后至少6个月以上患者的PBMCs，该时间段患者经急性期治疗进入恢复期，病情已处于稳定阶段，但这些患者机体中仍然存在数十种蛋白表达异常，提示尽管患者病情已趋于稳定，但体内可能仍有病理过程在发生，如果能针对这些异常蛋白或其所在信号通路予以干预，有可能会促进脑卒中患者的康复和防止再发。

图3 IS组和对照组差异表达基因KEGG分析结果

表1 IS组和对照组差异表达蛋白功能富集和信号通路分析列表

注：BP：biological process(生物过程)；CC：cellular component(细胞组成)；MF：molecular function(分子功能)

注：每个圆圈代表一种基因，小圈表示该蛋白3D结构尚未知，大圈表示该蛋白3D结构已知；直线表示蛋白质之间的相互关系，线越粗表示二者之间的相互作用更强图4 IS组和对照组差异表达基因相互作用网络图

3.2炎性反应和免疫反应在脑卒中恢复稳定期病程中的作用大量动物实验和临床研究表明，炎性反应和免疫反应在脑卒中发病后早期扮演着重要角色，影响脑卒中的预后和治疗[9-12]。研究发现，通过抑制miR-155能显著降低脑卒中模型小鼠造模7 d后CCL12和CXCL3等细胞因子的表达，减轻脑卒中后的炎性反应，促进组织修复[13]。Edwards等关于儿童动脉性IS的文献综述也提示，早期运用调节免疫和炎性反应的药物治疗，对动脉性IS的发生和复发可能有预防作用[14]。目前有关炎性反应和免疫反应在脑卒中恢复期中的作用研究甚少，仅见少量报道[15-16]。如Rooth等报道了凝血酶激活的纤溶抑制物(thrombin activatable fibrinolysis inhibitor，TAFI)在缺血性脑卒中急性期和恢复期中与纤溶和炎性反应的关系[15]。

本研究通过对脑卒中患者恢复稳定期PBMCs生物芯片的再分析发现，脑卒中后与炎性反应密切相关的10种差异表达蛋白，分别为CCL20、CXCL1、PTGS2、TNFAIP3、TNF、CCL3L3、CXCL2、CXCL3、IL1B和CXCL8，以及与免疫反应密切相关的10中差异表达蛋白，分别是RGS1，CCL20、HLA-DQA1、CXCL1、TNF、OSM、CXCL2、CXCL3、IL1B、CXCL8。尽管其中部分蛋白在脑卒中后早期病理改变中的作用已有较多研究，如CXCL1、PTGS2和TNF等，但在恢复期中其确切作用尚不清楚；同时，部分差异蛋白在脑卒中后的作用研究较少或尚未涉及，如CCL20、TNFAIP3、CCL3L3、CXCL3、RGS1和HLA-DQA1等。差异表达基因相互作用网络结果也发现，以上蛋白相互间具有紧密联系，提示这些蛋白及其相关信号通路可能成为脑卒中发病及治疗过程中的新靶点，也可能成为预测脑卒中再发的标志分子，值得进一步进行研究验证。

3.3TNF和CXCL8分子参与脑卒中恢复稳定期多种病理过程和信号通路作者所在团队前期研究和既往研究结果均表明，TNF在IS早期梗死病灶核心区组织及血管修复中有重要作用[17-19]。脑缺血后早期，小胶质细胞被激活，神经源性和免疫调节性细胞因子TNF产生增加，参与脑缺血后的各种病理生理过程[20]。本研究结果显示，TNF可能在脑卒中恢复稳定期同样具有重要作用，不仅通过参与免疫和炎性反应影响脑卒中的病程发展，还可能通过参与细胞增殖、凋亡、NO合成、糖皮质激素反应、内皮屏障功能调节等多种生物过程，导致脑缺血后恢复稳定期一系列病理改变。

值得关注的是，本研究发现趋化因子CXCL8可能是脑卒中恢复稳定期病理发展过程中一个重要的影响因子，通过GO富集分析和KEGG信号通路分析发现，在IS恢复稳定期阶段，差异表达基因在趋化因子调节的生物过程和相关信号通路显著富集。但目前趋化因子及其相关通路在脑卒中的作用研究甚少，其确切临床意义尚需进一步研究。

综上所述，本研究通过生物信息学方法，进一步分析了IS恢复稳定期患者PBMCs基因芯片，筛选出若干差异表达基因，找到一些可能成为脑卒中恢复稳定期研究新的靶分子和信号通路，为脑卒中恢复稳定期治疗和再发预测提供了新思路。

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BioinformaticstudyondifferentialexpressiongenesinPBMCscollectedfromischemicstrokepatientsduringconvalescentphase

PENGBin,ZHANGXue,CAOFanfan,WANGYing,SUNJialan,JIANGMei,LILongxuan*.

*DepartmentofNeurology,ShanghaiGongliHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200135,China

LI Longxuan，Email：Longxuanlee2006@yahoo.com

ObjectiveTo screen differential expression genes (DEGs)in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with ischemic stroke (IS) during convalescent phase, and to analyze their functional characteristics, in order to further understand the pathologic mechanism of stroke and provide some bioinformatic clues.MethodsThe data of Chip GDS4521 collected from PBMCs in the convalescent phase of IS were chosen from the GEO database. GEO2R analysis tools were used to search for DEGs, and the characteristics of gene function enrichment and related signal pathways in these DEGs were analyzed by DAVID, g: profiler and String.ResultsCompared with the normal control group, the expression of 37 genes in PBMCs was significantly changed in the IS recovery period (> 6 months), 34 of which were significantly increased and 3 genes decreased significantly. Gene Ontology (GO) analysis showed that in biology process these DGEs were mainly involved in inflammatory process, neutrophil chemotaxis, cell proliferation and apoptosis, and signal transduction.In molecular function most of them are related to chemokine activity and receptor binding, transcription factor activity, cytokine activity, and so on. KEGG signaling pathway analysis showed that the DEGs were mainly involved in TNF, NF-κB, chemokines, TOLL-like receptors and NOD-like receptors signaling pathways. The network map of the DEGs revealed that these genes were mainly dominated by two network maps related to inflammation.ConclusionsThis study demonstrated that many functional proteins and multiple signaling pathways may change at least 6 months after IS, especially in inflammation-related proteins and pathways, suggesting that inflammatory response might play a key role not only in acute but also in convalescent phase of IS.

ischemic stroke;bioinformation; gene chip;differential expression gene

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.05.002

国家自然科学基金面上项目(81571203)；上海市自然科学基金项目(15ZR1437200)；上海市浦东新区卫生系统领先人才培养计划(PWR12014-05)；上海市医学重点专科建设计划项目(ZK2015B16)；上海市卫计委科研项目(201540394)；上海市卫生计生系统优秀学科带头人(百人计划)(2017BR051)

200135上海市浦东新区公利医院&第二军医大学附属公利医院中法合作中心实验室(彭彬、张雪、曹帆帆、王莹)，神经科(孙家兰、江梅、李龙宣)

李龙宣，Email：Longxuanlee2006@yahoo.com

R743.3

A

1006-2963(2017)05-0318-06

2016-12-19)

(本文编辑：时秋宽)