视神经脊髓炎转基因(2D2)鼠的繁殖和鉴定

薛慧如 张美妮

视神经脊髓炎转基因(2D2)鼠的繁殖和鉴定

薛慧如 张美妮

目的建立视神经脊髓炎转基因(2D2)小鼠的繁育方法，并对其子代鼠进行基因鉴定。方法将雌雄2D2转基因小鼠各1只与C57BL/6野生型小鼠(1∶1)进行交配，由鼠尾血提取基因组DNA，应用PCR技术扩增，电泳后观察2D2转基因传代小鼠的基因表型。结果共繁育产生56只子代小鼠，其中36只子代小鼠基因组DNA扩增出657 bp的2D2条带，阳性率为64.3%。结论成功利用杂交方式有效繁殖2D2转基因鼠和应用PCR技术进行基因鉴定，为后续视神经脊髓炎的实验研究奠定了基础。

视神经脊髓炎；2D2转基因；繁殖；基因鉴定

视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)及其谱系疾病(NMO spectrum disorders，NMOSD)是一类选择性损伤视神经和脊髓的中枢神经系统自身免疫性疾病，主要累及年轻女性，复发率和致残率较高[1-2]。水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP4)抗体的发现使人们认识到NMO是有别于多发性硬化(multiple sclerosis，MS)的一种独立疾病实体[3]。该病在亚洲地区的高发病率使其逐渐成为近年来神经免疫领域研究的热点。2015年国际NMO诊断小组(IPND)制定了新的NMOSD诊断标准，进一步对NMO进行分层诊断，分为AQP4-IgG阳性和AQP4-IgG阴性，并分别制定了相应的诊断细则[4-5]。

据文献报道，AQP4-IgG阳性的NMO动物模型主要有以实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)为基础的被动转运NMO模型以及经颅注射NMO-IgG、补体及细胞因子的NMO模型[6-8]。AQP4-IgG阴性的NMO模型主要以2D2转基因小鼠模型为代表，此模型首先由Bettelli等和Krishnamoorthy等团队于2006年建立，是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)特异性T细胞转基因鼠和特异性B细胞受体转基因鼠杂交形成的双转基因C57BL/6鼠，能较好地模拟人类NMO的病理和临床等疾病特点[9-11]。本研究通过引进并繁育2D2转基因小鼠，利用PCR技术对其子代鼠进行基因鉴定，为今后进一步研究AQP4-IgG阴性的NMO提供了实验动物的可能。

1 材料和方法

1.1动物引进6周龄2D2转基因小鼠(美国Jackson Lab)2只，雌雄各1只，分别与同周龄的C57BL/6野生型小鼠进行交配。繁殖所产生后代小鼠56只，1～4月龄，分笼喂养于山西医科大学实验动物中心(Specific Pathogen Free，SPF级)。

1.2主要试剂和仪器主要试剂包括Marker(TaKaRa宝生物工程有限公司)、引物和PCR SuperMix(华大基因公司)。主要仪器包括MX3005P型PCR仪(美国Agilent公司)以及ChemiDoc XRS+型凝胶成像分析系统、PowerPac Basic型电泳仪、水平式电泳槽(美国Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1饲养与繁殖法：实验动物遵照国家实验动物饲养和使用指南，饲养环境在恒温(25～27℃)、恒湿(40%～50%)和无菌条件的隔离罩(SPF级)中，12 h/12 h明暗循环，自由饮食和饮水。2只2D2转基因小鼠分笼饲养1周适应新的环境后，分别与1只异性C57BL/6野生型小鼠合笼喂养，每天观察雌鼠情况，待判断雌鼠怀孕后将雄鼠拿出，雌鼠在原笼中单独饲养。雌鼠孕期约20 d左右，每次可生产3～10只小鼠，新生鼠出生后第1周不换垫料，子代鼠与母鼠合笼喂养4周后，子代鼠可取出分笼饲养。父代(母代)2D2转基因小鼠继续与C57BL/6野生型小鼠合笼交配。

1.3.2基因鉴定：(1)DNA提取：以子代鼠鼠尾基因组DNA为模板进行PCR鉴定，同时选取C57BL/6野生型小鼠基因组DNA作为阴性对照。将待鉴定的小鼠分笼后打耳标，并剪取小鼠尾巴3 mm放入编号的EP管中，放入50 mmol/L NaOH溶液250 μL，置恒温水浴锅中95℃加热90 min。待EP管冷却后，加入1 mol/L Tris溶液(pH 8.0)50 μL充分混匀，以12000g离心6 min。取上清约200 μL置于EP管中，-20℃保存。(2)PCR反应：引物序列：2D2-F：5′-CCCGGGCAAGGCTCAGCCATGCTCCTG-3′，2D2-R：5′-GCG GCCGCAATTCCCAGAGACATCCCTCC-3′，对照-F：5′-CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT-3′，对照-R：5′-GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC-3′。反应体系50 μL，扩增条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸7 min。(3)PCR产物鉴定：PCR产物用1.5%(质量浓度)琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像分析系统观察分析条带吸光度值。琼脂糖凝胶上的PCR条带出现与2D2基因PCR产物大小一致的条带为阳性结果，否则为阴性结果，出现内参基因PCR产物大小一致的条带表明PCR操作方法正确。

2 结果

共繁殖产生子代鼠63只，成活56只，成活率88.9%。子代鼠基因组DNA的PCR产物电泳结果见图1。2D2基因的PCR产物大小为675 bp，内参基因的PCR产物大小为324 bp。子代鼠中2D2基因阳性率为64.3%(36/56)，阴性率(即野生型)为35.7%(20/56)。其中雄鼠2D2基因的阳性率为65.6%(21/32)，雌鼠的阳性率为62.5%(15/24)。

注：M：DNA marker；1.3：2D2转基因阴性小鼠；2、4、5、6、7、8∶2D2转基因阳性小鼠；9、10、11：内参基因；12：C57BL/6野生型小鼠图1 2D2转基因小鼠基因表型的鉴定(PCR法)

3 讨论

NMO主要临床表现为视神经和脊髓损害两大组症状，部分患者合并有大脑损害症状。视神经损害更易累及视神经后段及视交叉，病变节段可大于1/2视神经长度，脊髓症候以横惯性脊髓损害较为多见，多大于3个椎体节段[2，4]。在NMO发病过程中，T细胞辅助B细胞产生NMO-IgG，NMO-IgG与星形胶质细胞(astrocyte，AS)上的AQP4特异性结合后改变了AQP4极性分布，在补体辅助下激活补体依赖和抗体依赖的细胞毒途径，导致AS坏死和髓鞘破坏[12]。NMO急性期病灶的主要病理特点是星形胶质细胞损伤和破坏，病灶内大量中性粒细胞浸润，抗体和补体沉积在血管周和软膜下聚集成“玫瑰花环”样改变[13-14]。

AQP4-IgG阳性的几种NMO动物模型均有其各自的优缺点。EAE联合NMO-IgG被动转移模型无法造成髓鞘损伤，要求的NMO-IgG量大；NMO-IgG和细胞因子直接注射模型操作繁琐，对实验者的操作要求较高[15-16]。这些模型病灶均在实验动物的大脑，并不在NMO的视神经和脊髓常见部位，此外还存在不同遗传背景的鼠系所建立的NMO模型临床和病理学表现迥异等问题[17]。

临床上部分NMO患者血清AQP4-IgG阴性，提示还存在AQP4-IgG以外的其他免疫因素参与NMO的发病机制[18-19]。在新发现的NMO相关抗体中，MOG是研究最多的另一自身免疫抗体。Mader等首先发现部分血清AQP4-IgG阴性NMO患者存在MOG-IgG介导的免疫反应[20]。Bettelli等和Krishnamoorthy等分别于2006年建立的2D2转基因小鼠模型，是由MOG特异性T细胞转基因鼠和特异性B细胞受体转基因鼠杂交形成，此模型鼠能模拟人体内T细胞和B细胞的免疫应答反应，自发出现视神经炎及严重的脊髓炎表现，却不累及大脑，无补体沉积的病理改变[9-10]，这为研究NMO-IgG阴性的NMO发病机制、治疗策略等提供了可能性。转基因鼠的模型成功率较高，不受实验室操作者的技术影响，是当今研究NMO的热点模型。

本研究采用2D2转基因小鼠与C57BL/6野生型小鼠(1∶1)进行交配，繁殖速度快，产生子代鼠共63只，成活56只，成活率高，分析死亡的二窝共7只小鼠为初期雌鼠无喂养经验所致。提取鼠尾DNA的方式取材量少，取材后小鼠仍可正常饮食、活动，对其影响轻微，不干扰后继实验[21]。PCR法在筛选2D2转基因阳性鼠中具有准确可靠、简便易行和适合大批量检测的特点。在PCR扩增中设定内参照有助于避免因PCR扩增失败导致的假阴性结果。本研究子代鼠中2D2基因阳性率为64.3%，子代鼠中转入基因的遗传几率较高，其中雄鼠2D2基因的阳性率为65.6%，雌鼠的阳性率为62.5%，提示其阳性率无雌雄性别差异。2D2转基因小鼠的成功繁育和转基因阳性鼠基因鉴定方法的确立，为课题组今后对NMO-IgG阴性的NMO疾病的层次研究和治疗策略的摸索提供了基础。

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Reproductionandgenotypeidentificationof2D2transgenicmousemodelofneuromyelitisoptica

XUEHuiru,ZHANGMeini*.

*DepartmentofNeurology，theFirstHospitalofShanxiMedicalUniversity，Shanxi030001，China

ZHANG Meini, Email：meinizhang611@hotmail.com

ObjectiveTo breed and identify the genotype of 2D2 transgenic mouse model of neuromyelitis optica.MethodsThe male and female 2D2 transgenic mice mated with C57BL/6 wild type mice respectively (1∶1). Genomic DNA was isolated from blood cells from the tails and analyzed by PCR.ResultsThere were 36 2D2 transgenic mice identified by PCR in the generated 56 mice, and the 657 bp 2D2 genome DNA were detected in these 2D2 transgenic baby mice. The positive rate was 64.3%.ConclusionsThe appropriate methods of breeding is the effective way to acquire heterozygote baby mice with 2D2 transgenic mouse. It provides the foundation for the future experimental study of neuromyelitis optica.

neuromyelitis optica; 2D2 transgenic; breeding; genotype identification

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.05.005

校青年基金项目(02201513)

030001山西医科大学第一医院神经内科

张美妮，Email：meinizhang611@hotmail.com

R744.5+2

A

1006-2963(2017)05-0332-03

2016-12-14)

(本文编辑：时秋宽)