高效液相色谱法测定保健食品中叶酸条件优化

董娇+曹宁阳+乔玲+王烁+岑琴

摘要：采用二极管阵列检测器，以保留时间和紫外特征吸收光谱图作为定性依据，建立高效液相色谱法测定保健品中叶酸的方法。试验结果表明：叶酸检出限2.5μg/mg；在0.1～50 μg/mL浓度范围内线性关系良好；样品加标回收率在90.9%～105.0%之间，RSD小于3.55%，可作为保健食品中叶酸的定量分析方法。

关键词：高效液相色谱法；叶酸；限出限；加收率

中图分类号：R115.5 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2017）07-0052-02

叶酸（Folic acid）即维生素B9，是一种水溶性维生素。目前市场上销售的营养保健品基本都添加叶酸。叶酸含量测定有分光光度法、微生物法、高效液相色谱法和高效液相色谱质谱联用法。食品中的叶酸检验国标方法为微生物法，试验周期较长；分光光度法灵敏度较低，选择性较差；高效液相色谱质谱联用法仪器造价较高，不利于推广应用；2005年版《中国药典》中的叶酸测定采用高效液相紫外检测器法，前处理简单，但只适用于叶酸含量高的样品，且流动相组成复杂，对色谱柱伤害较大。为此，采用高效液相色谱二极管阵列检测器检测保健食品中的叶酸，旨在建立一种简单、快速、准确的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

叶酸（批号139092）由Dr.Ehrenstorfer提供。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

岛津LC20A高效液相色谱仪，配有M20A二极管阵列检测器；HZF-A500电子天平：福州华志科学仪器有限公司；KQ-250DB超声波发生器：昆山市超声仪器有限公司；H2050R离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 HPLC色谱条件及色谱柱 Thermo Syncronis C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；

柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样量：20 μL。流动相：乙腈+0.2%磷酸水（10‥90）。

1.3.2 标准品溶液的配制 叶酸标准储备溶液（500 μg/mL）：准确称取叶酸标准品25 mg（精确至0.1 mg），置于50 mL容量瓶中，加入0.5%氨水溶解，定容至刻度。分别吸取标准储备溶液20 μL、200 μL、400 μL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、10.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用水定容，配制成浓度为0.1，1，2，5，10，20，50 μg/mL的标准系列工作溶液。

1.3.3 样品前处理 取样品20～30片，研磨粉碎（胶囊样品取出内容物研磨粉碎），称取1 g于25 mL容量瓶中，加0.5%的氨水10 mL，超声提取10 min，冷却至室温，加水定容至刻度，混合均匀；软胶囊样品，用注射器吸取其内容物1 g于50 mL离心管中，加入0.5%氨水5 mL及水15 mL，加入正己烷20 mL剧烈振荡3 min，弃去正己烷，水层移至25 mL容量瓶中，用水定容。

上述定容后的溶液高速离心（不小于4 000 r/min），取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择与优化

2.1.1 流动相的选择 目前叶酸测定多用缓冲盐作流动相，本试验选用乙腈-磷酸水作流动相。对比发现，两者的洗脱分离效果没有明显差异，但乙腈-磷酸水流动相的配制过程更为简单。分别用0.1%，0.2%，0.5%的磷酸溶液进行测定，结果表明：磷酸溶液浓度越大，叶酸色谱峰的峰形越尖锐，保留时间加长；随着磷酸浓度增加，溶液pH值降低。考虑色谱柱使用寿命，选择0.2%的磷酸溶液作为流动相。当乙腈与0.2%磷酸水的比例为10‥90时，可获得最佳分离效果且保留时间较短（见图1）。

2.1.2 检测波长选择 由叶酸标准品的紫外吸收光谱图1可知，叶酸在285 nm下吸光度最大，故检测波长定为285 nm，其特征吸收光谱图见图2。

2.2 提取液选择

叶酸在碱性溶液中稳定，而其他水溶性维生素在酸性条件下稳定，故用0.5%氨水提取样品中的叶酸，以避免其他水溶性维生素干扰。

2.3 标准曲线

将1.3.2中得到的叶酸标准系列工作溶液按1.3.1色谱条件进行检测，以峰面积为纵坐标（y，响应值）、质量浓度为横坐标（x，μg/mL）进行回归分析。结果表明，叶酸在0.1～50 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y=1.655 6e-0.05X-0.026 7，线性相关系数（r）为0.999 9。

2.4 检出限

在以上分析条件下，方法检出限为2.5 μg/mg（以3倍噪声计）。

2.5 回收率和精密度

取空白样品5份，加入不同浓度叶酸标样，按1.3.3进行样品前处理，进样20 μl，结果见表1。

2.6 样品分析

测定4种含有叶酸的保健食品，含量分别为397.4，363.5，117.0，154.3 μg/mg，平行样相对误差分别为0.2%，0.2%，0.3%，0.3%。实际样品分析证明，本方法操作简单，灵敏度高，适用于保健品中叶酸的测定。

3 结论

通过优化建立用高效液相色谱测定保健食品中叶酸的方法，方法检出限为2.5 μg/mg；0.1～50 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（r）为0.999 9；样品加标回收率在90.9%～105.0%之间，RSD小于3.55%。此测定方法的样品前处理简单，结果准确，灵敏度高，重复性好，可作为保健食品中叶酸的定量分析方法。

参考文献

[1] 郭丽琼，曹秋旭， 吴厚玖.果蔬中叶酸分析方法研究的进展[J].食品工业科技，2012，33 （10）：402-406.

[2] 才家庆，孙悦，赵姗姗.高效液相色谱法测定牙膏中叶酸的含量[J].口腔护理用品工业，2015，25 （4） ：9-12

[3] 郭丽仪，黄永连，梁咏瑜，等.高效液相色譜法测定维生素软糖中叶酸的含量[J].食品安全导刊，2017（15） ：134-136.

[4] 刘进玺，钟红舰，董小海.超高效液相色谱-质谱联用测定食品中叶酸含量[J].食品科学，2012，33（8）：233-235.

Abstract： To establish the method for determining folic acid added in health food by HPLC by using diode array detector and taking retention time and absorption sectrum of ultraviolet characteristic as qualitative basis.

The experimental results showed that： The detection limit of folic acid was 2.5 μg/mg； It had a good linear relation when the concentration ranging from 0.1 to 50μg/mL； The sample added recovery was between 90.9%～105.0%， RSD<3.55%. The method can be used as the quantitative analysis method to determine the folic acid added in health food.

Key words： HPLC； folic acid； detection limit； recoveryendprint