静止期牙周病动物模型的建立及其骨微结构的Micro-CT观察

周 芳,曾 辉,梁 斌,唐成芳,朱 勇

(西安医学院口腔医学系,西安 710021；*通讯作者,E-mail:zhuyong9023@qq.com)

静止期牙周病动物模型的建立及其骨微结构的Micro-CT观察

周 芳,曾 辉,梁 斌,唐成芳,朱 勇*

(西安医学院口腔医学系,西安 710021；*通讯作者,E-mail:zhuyong9023@qq.com)

目的 模拟临床牙周病患者正畸治疗的牙周病理环境,建立静止期牙周病动物模型,并使用Micro-CT观察其牙槽骨骨微结构的变化。 方法 将115只8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组(n=30)和实验组(n=85),用丝线结扎实验组小鼠右侧上颌第一磨牙建立静止期牙周病动物模型,结扎6周后去除结扎丝,将实验组小鼠随机分为牙周病组(n=35)和牙周治疗组(n=44),牙周病组小鼠不作处理,牙周治疗组小鼠进行常规牙周刮治,按照术后不同观察时期(牙周治疗后4周、6周、8周)分组、取材,进行Micro-CT观察,比较各组小鼠右侧上颌第一磨牙牙槽骨矢状面余留骨量百分比、骨密度、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁分离距离、骨小梁厚度的差别。 结果 成功建立静止期牙周病动物模型,样本符合观察要求。Micro-CT显示,牙周治疗后4周,牙周病组和牙周治疗组小鼠右侧上颌第一磨牙矢状面余留骨量百分比均小于对照组,差异有统计学意义(53.79%±10.07%,60.96%±12.14%vs89.13%±5.88%,P<0.05);牙周治疗组骨密度、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度均小于对照组,牙周治疗组骨小梁分离距离大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。牙周治疗后4周,牙周治疗组骨密度、骨小梁厚度大于牙周病组,骨小梁分离距离小于牙周病组,差异有统计学意义(P<0.05)。牙周治疗后8周,牙周病治疗组小鼠骨小梁分离距离小于牙周治疗后4周,骨小梁厚度大于牙周治疗后4周,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 本实验建立的静止期牙周病动物模型设计合理,科学易行,可以模拟临床牙周病患者正畸治疗的牙周病理环境,为研究牙周病患者正畸治疗的方式和效果提供有利条件。

牙周病; 静止期; 动物模型; Micro-CT

牙周病是危害人类健康的口腔疾病之一。全世界有8%-30%的中年人为牙周病患者,牙周病已成为继龋齿及其并发症之外引起牙齿缺失的主要原因之一[1],一直是口腔医学研究的重点和难点。慢性牙周炎不仅影响患者的咀嚼功能,还严重影响美观,相比常规的牙周基础治疗,牙周-正畸联合治疗可以改善患者的咀嚼功能及外观,解决咬合创伤,有利于牙周组织的恢复,效果显著[2,3]。但是,也有学者发现部分患者在正畸治疗中有牙齿松动、牙槽骨形态异常的情况[4],这可能是患者静止状态的牙周炎症被激活,出现类似于牙周病活动期的症状,但该病理过程还需进一步研究证实[5]。

牙槽骨吸收是牙周炎的典型病理性改变,也是判定患牙预后的重要依据,牙槽骨吸收包括牙槽骨体积减小和牙槽骨密度降低,通过组织病理形态学计量法进行评估,标本易变形,难以保证切面测量位点的准确性[6],更无法测量三维体积。X线片光密度法或各种骨密度仪的测量结果也不能反映骨微结构的改变[7]。近年来,高分辨率的显微计算机断层扫描技术(Micro-CT)作为一种无损检测手段,其图像三维重建功能可清晰显示骨组织的立体结构,并能精确测量反映骨微结构变化的相关指标,已逐渐用于对骨组织的评估。

目前,有多位学者在研究牙周组织再生,此类研究大多采用急性牙周缺损模型,该类模型具有干扰因素少的优点,但是急性牙周缺损模型并不能如实地反映复杂的慢性牙周病状况,尤其牙周-正畸联合治疗时要求在患者牙周病处于静止期才能进行。因此,本实验建立了静止期牙周病动物模型,以便更好地模拟牙周病患者牙周-正畸联合治疗时的真实局部微环境,通过Micro-CT影像以及组织形态学的观察,探索静止期牙周病动物模型在建立过程中的影像学、组织学表现,为研究静止期牙周病动物模型牙齿移动时牙槽骨的变化提供实验基础,以期为牙周病患者的正畸治疗提供更多实验依据和方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

8周龄雄性C57BL/6小鼠115只(SPF级),平均体质量(23±1.4)g,购自华东师范大学动物中心,实验动物生产许可证:SCXK(沪)2013-0031,实验动物使用许可证:SYXK(沪)2012-0094。

1.2 主要器械与设备

自制牙周刮治器:将探针双弯的一端最末端3 mm烧灼后用重物敲击呈扁平状,之后用低速手机修整宽度及边缘,使其一边圆钝,一边锐利,使用时根据动物模型牙齿颊面、舌面、近中、远中做适当角度调整,不同位置分别制作。

Skyscan Micro-CT系统(型号:1076):该系统具有目标定位、目标定量、3D重构功能,三维成像系统在目前所有的活体MICO-CT系统中具有最高的分辨率,成像结果更加清晰,适用于肿瘤学研究、骨代谢研究、干细胞研究和药物筛选,软件系统能完成定位、体积测算、动画制作等功能。

1.3 建立牙周病动物模型

小鼠在清洁安静的环境下适应性喂养1周后采用完全随机分组方法,将小鼠分为对照组和实验组,对照组30只,实验组85只。实验组小鼠用甲苯噻嗪(5 mg/kg)和氯胺酮(100 mg/kg)麻醉后仰卧固定,四肢及头部固定于木板上,开口器牵开口角,丝线结扎小鼠右侧上颌第一磨牙牙颈部,并置于龈下,在腭侧打结,压入龈沟内,隔天检查结扎丝,有脱落、松动的重新结扎,以建立牙周病动物模型。建模6周后检查小鼠右侧上颌第一磨牙牙周情况,以牙周袋探诊深度和牙周探诊出血作为评价标准,评价由同一名医生完成。之后随机处死5只小鼠制作牙周组织学切片。对照组不作任何处理,置于实验组同样饲养环境进行饲养,自由进食、饮水。

1.4 动物模型牙周治疗

牙周病动物模型建立成功后,麻醉小鼠,仰卧固定,去除实验组小鼠右侧上颌第一磨牙牙颈部的结扎丝,采用完全随机分组方法将建模成功小鼠分为牙周病组和牙周治疗组,牙周病组35只,牙周治疗组44只。对牙周治疗组小鼠右侧上颌第一磨牙行牙周改良切口,翻瓣,充分暴露病变区,自制刮治器刮除炎性肉芽组织,修整袋内壁,并用生理盐水反复冲洗,术后应用抗生素(庆大霉素注射液5 ml/kg,1次/d)下肢肌肉注射预防感染,连续用药3 d,自由进食经粉碎处理的消毒固体颗粒饲料。手术过程顺利,术后伤口愈合良好。建模10周(牙周治疗后4周),检查小鼠右侧上颌第一磨牙牙周情况,以牙周袋探诊深度和牙周探诊出血作为评价标准,评价由同一名医生完成。之后随机处死4只小鼠制作牙周组织学切片。牙周病组不作任何处理,置于同样饲养环境进行饲养,自由进食、饮水。

建模10周后,牙周病治疗组小鼠大部分牙龈颜色基本正常,牙龈退缩。牙周治疗组小鼠牙周组织可见牙槽骨遗留吸收陷窝,少量炎症细胞浸润,胶原纤维修复,证明动物模型牙周病处于静止期。

1.5 观察模型的制取

对照组、牙周病组、牙周治疗组分别在建模后第10周、12周和14周(即牙周治疗后4周、6周、8周)分批断颈处死小鼠,每组各时间点处死的动物均为10只。小鼠处死后,取右侧上颌骨,剔除上面的软组织,生理盐水冲洗,浸泡于10%甲醛溶液中保存,以备骨组织形态计量学相关指标的检测(见图1)。

图1 动物模型建立过程流程图Figure 1 Process flow chart of animal model establishment

1.6 骨组织结构参数测量

1.6.1 Micro-CT扫描方式 360°旋转,电压80 kV,电流80 μA。图片分辨率1 024×1 024,层距18 μm,曝光时间2 960 ms。扫描结束后,采用Micro-View系统对扫描所获影像进行三维重建,CT值高于1 000定义为硬组织。

1.6.2 二维线性分析 调整所有图像使动物模型第一磨牙、第二磨牙、第三磨牙的釉牙骨质界(CEJ)与根尖孔(RA)处在同一矢状水平的二维图像上,然后采用MicroView系统进行2-D线性分析(见图2)。通过线性分析分别测量小鼠右侧上颌第一磨牙近远中牙槽嵴顶点(ABC)至近远中釉牙骨质界的垂直距离(ACJ)以及釉牙骨质界到根尖孔之间的垂直距离(RLS),重复测量3次,取平均值。按照公式:余留骨的百分比(%)=(RLS-ACJ)/RLS×100%,计算动物模型右侧上颌第一磨牙近远中牙槽嵴余留骨的百分比,再将近远中牙槽嵴余留骨的百分比取平均值,计算出动物模型右侧上颌第一磨牙矢状面余留骨量的百分比。

图2 第一磨牙矢状面余留骨量百分比的2-D线性分析Figure 2 2-D linear analysis of the percentage of residual bone mass in the first molar

1.6.3 三维测量 使用Micro-CT扫描动物模型右侧上颌骨,选用三维兴趣区间(3D ROI)工具形成三维兴趣区。用图像分析软件MicroView定量分析反映骨微结构的相关参数,测量分析指标包括:骨密度(BMD),即选定的ROI中的总骨矿物质密度;骨体积分数(BV/TV),即选定的ROI内骨小梁的体积除以样本的体积;骨小梁数量(Tb·N),即给定长度内骨组织与非骨组织的交点数量;骨小梁分离距离(Tb·Sp),即骨小梁之间的髓腔平均宽度;骨小梁厚度(Tb·Th),即骨小梁的平均厚度。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 建模成功率

实验组85只小鼠用丝线结扎右侧上颌第一磨牙后,在结扎第4周至第6周有6只小鼠死亡,其余小鼠结扎6周后牙龈肿胀,呈现暗红色,冠周出现组织坏死且探诊出血,牙周袋深,在其中随机处死5只小鼠制作牙周组织学切片,可见小鼠牙周血管扩张、牙周纤维排列紊乱,大量炎性细胞侵润,牙槽骨可见破骨细胞及吸收陷窝。Micro-CT扫描显示小鼠右侧上颌第一磨牙牙槽骨重度吸收,牙根暴露,证明牙周病动物模型建立成功,牙周病动物模型建模成功率约为93%。

牙周治疗组44只小鼠经过常规牙周刮治,在牙周治疗后2周内有7只小鼠死亡,牙周治疗4周后,有3只小鼠牙龈肿胀,探诊出血,其余小鼠牙龈颜色基本正常,牙龈退缩,在其中随机处死4只小鼠制作牙周组织学切片,可见牙槽骨遗留吸收陷窝,少量炎症细胞侵润,胶原纤维修复。Micro-CT扫描显示牙周治疗组小鼠右侧上颌第一磨牙牙槽骨骨密度、骨小梁厚度高于牙周病组,骨小梁分离距离低于牙周病组,证明动物模型牙周病处于静止期,静止期牙周病动物模型建模成功率约为77%。

2.2 二维测量结果

2-D线性分析结果显示,建模10周(即牙周治疗后4周),牙周病组、牙周治疗组小鼠右侧上颌第一磨牙矢状面余留骨量均小于对照组,但牙周病组、牙周治疗组小鼠右侧上颌第一磨牙矢状面余留骨量没有统计学差异(见表1)。

表1右侧上颌第一磨牙矢状面余留骨量百分比

Table1Thepercentageoftheresidualbonemassofthefirstmolarontherightupperjawinthreegroups

组别n余留骨量(%)对照组 108913±588 牙周病组 305379±1007∗牙周治疗组306096±1214∗

与对照组比较,*P<0.05

2.3 三维测量结果

2.3.1 治疗4周各组小鼠骨微参数比较 建模10周(即牙周治疗后4周),牙周病组和牙周治疗组骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb·N)、骨小梁厚度(Tb·Th)均小于对照组;骨小梁分离距离(Tb·Sp)大于对照组。牙周治疗组骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb·Th)大于牙周病组,骨小梁分离距离(Tb·Sp)小于牙周病组,差异有统计学意义(P<0.05,见表2,图3)。

组别nBMD(mg/cm2)BV/TV(%)Tb·N(mm-1)Tb·Sp(μm)Tb·Th(μm)对照组 1037245±4686015±485241±0174288±7298864±908牙周病组 3028865±1143∗4327±328∗137±029∗7146±538∗5782±614∗牙周治疗组3032983±1537∗#4883±607∗153±052∗6227±1076∗#6334±873∗#

与对照组比较,*P<0.05;与牙周病组比较,#P<0.05

图3 牙周病动物模型Micro-CT三维图像 Figure 3 3D image of Micro-CT of periodontaldisease animal model

2.3.2 牙周治疗后4周、6周、8周骨微参数比较 建模10周、12周(即牙周治疗后4周、6周)牙周治疗组小鼠各项骨微参数无明显变化,建模14周(即牙周治疗后8周),牙周治疗组小鼠骨小梁分离距离(Tb·Sp)(50.17±9.52)低于牙周治疗后4周(62.27±10.76),骨小梁厚度(Tb·Th)(76.78±7.88)大于牙周治疗后4周(63.34±8.73)(见表3,图4)。

时间nBMD(mg/cm2)BV/TV(%)Tb·N(mm-1)Tb·Sp(μm)Tb·Th(μm)4周1032983±15374883±607153±0526227±10766334±8736周1033817±13345221±734160±0395513±7336831±9358周1035039±10665578±856162±0245017±952∗7678±788∗

与4周比较,*P<0.05

A.牙周治疗后4周;B.牙周治疗后6周,各项骨微参数无明显变化;C.牙周治疗后8周,骨小梁分离距离低于牙周病治疗后4周,骨小梁厚度大于牙周病治疗后4周图4 牙周治疗后动物模型牙周治疗后Micro-CT三维图像Figure 4 3D image of Micro-CT after periodontal treatment of animal model

3 讨论

3.1 实验动物的选择

用于建立牙周病模型的动物有许多种,如鼠、狗、兔、小型猪和各种灵长类。鼠磨牙牙周组织的结构和组成与人的极为相似,且鼠价格便宜,容易控制,并且小鼠具有体积小、便于饲养、实验用抗体种类多等优点,故更适宜建立静止期牙周病动物模型。

3.2 建模方式的选择

目前,建立实验性牙周病模型的方法主要有口腔应用牙周致病菌、丝线结扎、饮食和牙龈注射脂多糖等方法,所有方法均可导致不同程度的牙槽骨破坏。有研究表明,丝线结扎比牙龈卟啉单胞菌更快地诱导牙周组织炎症反应及牙槽骨破骨细胞分化[8]。高糖饮食也确实可以促进牙周疾病的发生,但是患有糖尿病时,宿主会对病原微生物产生过度的炎症反应,并使炎症反应延长[9],糖尿病还会造成骨吸收加强,从而影响牙周组织中牙槽骨的正常结构[10]。考虑到通过高糖饮食建立的模型会对下一步在静止期牙周病动物模型上进行其他研究带来干扰,本实验建立的牙周病动物模型采用丝线结扎牙周的方式获得,并不辅助高糖饮食,以期更加符合临床实际,尽量减少其他干扰因素。

在本研究中,建模10周(即牙周治疗4周),牙周病组和牙周治疗组骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb·N)、骨小梁厚度(Tb·Th)均小于对照组,骨小梁分离距离(Tb·Sp)大于对照组;牙周治疗组骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb·Th)大于牙周病组,骨小梁分离距离(Tb·Sp)小于牙周病组,差异有统计学意义(P<0.05),表明牙周治疗后4周,静止期牙周病动物模型建立成功。牙周治疗后4周、6周,牙周治疗组小鼠各项骨微参数无明显变化,牙周治疗后8周,仅有骨小梁分离距离(Tb·Sp)、骨小梁厚度(Tb·Th)大于牙周病治疗后4周,故在静止期牙周病动物模型上进行实验研究可以在牙周治疗后4周开始。

3.3 观察方式的选择

牙周炎中牙槽骨的吸收呈现非均一性,不能体现不规则的牙槽骨吸收情况,也不能实时的反映牙槽骨骨微结构的变化,而Micro-CT可以在不破坏样本的情况下,对离体样本和活体小动物进行高分辨率的成像,从而获得样品内部详尽的三维结构信息[11]。有研究表明,Micro-CT的2-D形态学测量与传统的组织病理骨形态计量学结果具有高度相关性,是一种可以取代普通组织病理切片的新方法,同时Micro-CT对骨量的三维定量分析不仅反映骨量相关因素,还反映骨小梁的三维结构及骨小梁间的连结程度[12]。本实验即采用Micro-CT系统研究动物模型的整个建立过程,更直观地展示动物模型各时期牙槽骨量和骨微结构的变化,成功建立了可以模拟牙周病患者正畸治疗病理环境的静止期牙周病动物模型,可以使后续实验更加符合临床实际情况,为研究静止期牙周病动物模型牙齿移动牙槽骨变化提供了非常有力的条件。

3.4 建模的临床意义和应用前景

流行病学调查显示,牙周炎是我国成年人丧失牙齿的首位原因,因为牙槽骨炎性吸收破坏,牙齿支持能力下降而无法承担正常的咀嚼压力,出现创伤,进一步加剧牙槽骨的吸收,以致进入恶性循环,表现为牙齿松动,移位,咀嚼无力等。正畸治疗是牙周炎综合治疗的重要方法之一,通过复位松动移位牙,改变牙长轴及其受力方向,消除创伤性咬合力,有利于牙周组织的恢复。但是,牙周病患者的正畸治疗还存在很大风险,受很多因素制约,不是所有牙周病患者接受正畸治疗都可以获得很好的治疗效果,在临床实践中常可发现,牙周病静止期的患者正畸治疗过程中常常有牙齿松动度增加,附着丧失加重,以及牙槽骨高度和密度降低等牙周破坏现象。也就是说,正畸治疗可能在一定程度上加速了牙周病的进展,而且下颌牙槽骨对正畸治疗的反应更为敏感[13]。

目前,尚无促进牙周病患者牙槽骨再生的有效方法,牙周病正畸治疗并不仅是在牙周常规治疗基础上采用的辅助治疗,而应该是抑制牙槽骨吸收,促进骨再生的治疗方式之一[14],因此,对牙周病患者正畸治疗过程中牙槽骨的重建及其影响因素的研究具有重要的理论和实践意义,但此类研究需要先建立一个与临床环境非常接近的研究模型,在此模型上观察得到的结果才更符合临床需要。

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EstablishmentofanimalmodelofquiescentperiodontitisandMicro-CTervationofbonemicrostructure

ZHOU Fang,ZENG Hui,LIANG Bin,TANG Chengfang,ZHU Yong*

(DepartmentofStomatology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China;*Correspondingauthor,E-mail:zhuyong9023@qq.com)

ObjectiveTo establish an animal model of stationary periodontitis for simulating the periodontal pathological environment of orthodontic patients in orthodontic treatment, and to observe the changes of microstructure of alveolar bone by Micro-CT.MethodsThe mice were randomly divided into control group(n=30) and model group(n=85). The first maxillary right molar was ligated in experimental group,and dislodged 6 weeks later. The model mice were randomly divided into periodontal disease group(n=35) and periodontal treatment group (n=44).The mice were not treated in periodontal disease group, but treated with conventional periodontal scaling in periodontal treatment group, and the microstructure of alveolar bone was observed by Micro-CT after periodontal treatment for 4 weeks, 6 weeks, 8 weeks. And the residual bone mass, bone density, bone volume fraction, number of trabecular bone, separation of trabecular bone and thickness of trabecular bone at first molar on the right upper jaw were compared.ResultsAn animal model of quiescent periodontitis was established successfully, and the model met the requirements of the observation.At 4 week after periodontal treatment, the residual bone mass of the first molar on the right upper jaw was lower in periodontal disease group and periodontal treatment group than in control group(53.79%±10.07%, 60.96%±12.14%vs89.13%±5.88%,P<0.05), and bone density, bone volume fraction, number of trabecular bone and thickness of trabecular bone were lower in periodontal treatment group than in control group, and the distance of trabecular bone separation was larger in periodontal treatment group than in control group(P<0.05). At 4 week after periodontal treatment, the bone density and the thickness of trabecular bone were higher in periodontal treatment group than in periodontal disease group, and the distance of trabecular bone separation was lower in periodontal treatment group than in periodontal disease group. At 8 week after periodontal treatment, the distance of trabecular bone separation in periodontal disease group was lower than that at 4 week after periodontal treatment, and the thickness of trabecular bone in periodontal treatment group was higher than that at 4 week.ConclusionThe animal model of stationary periodontitis established in this experiment is reasonable and scientific, which can be fully used to simulate the case of orthodontic treatment of patients with periodontal disease and provide favorable conditions for the further study of orthodontic treatment of periodontal disease.

periodontal disease; stationary; animal model; Micro-CT

陕西省教育厅科研计划项目(16JK1659);陕西省卫生科研扶植项目(2016D022)

周芳,女,1981-12生,硕士,副教授,E-mail:15102926285@163.com

2017-07-30

R783.5

A

1007-6611(2017)11-1154-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.014