甜菜BvBHLH92基因组织表达及亚细胞定位研究

王宇光， 李海英

(黑龙江大学 a. 农作物研究院; b．生命科学学院; c．黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室; d.农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150080)

甜菜BvBHLH92基因组织表达及亚细胞定位研究

王宇光a， 李海英b，c，d，*

(黑龙江大学 a. 农作物研究院; b．生命科学学院; c．黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室; d.农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150080)

BHLH蛋白家族是一类含有BHLH结构域，并广泛存在于植物中的一类重要转录因子。前期从甜菜中克隆得到了甜菜BvBHLH92基因，本研究对BvBHLH92基因的蛋白序列、组织表达及亚细胞定位进行分析。研究发现甜菜BvBHLH92蛋白包含225个氨基酸，并具有BHLH转录因子基因家族的典型功能结构域。同时，系统发育分析发现BvBHLH92蛋白与甜菜BvBHLH93及拟南芥AtBHLH92亲缘关系较近。组织特异性表达检测表明BvBHLH92基因在甜菜花中表达量最高，而在根部位表达量最低，进一步研究发现BvBHLH92基因在甜菜根和叶部位响应盐胁迫诱导表达。此外，亚细胞定位分析证明BvBHLH92蛋白定位在细胞核，推测BvBHLH92蛋白在细胞核中调控相关基因的表达，进而调节甜菜对盐胁迫的响应变化。

BHLH; 转录因子；亚细胞定位；盐胁迫

转录因子又称反式作用因子，它是一类可结合在基因上游的启动子区段，并调控目的基因转录表达的蛋白质[1]。通常植物通过一系列的信号感知途径，进行转录因子激活，促使转录因子与下游调控基因的顺式作用元件相结合，调控目的基因在特异的组织部位以特定的强度进行表达。已报道的大约植物基因组中7%的序列可能参与编码转录因子蛋白，而其中很大部分转录因子是植物响应非生物盐胁迫的早期应答反应基因[2-5]。目前已报道的与植物盐胁迫响应及耐盐相关转录因子家族有BHLH、MYB、WRKY、bZIP及NAC类等[6]。

BHLH蛋白家族是一类含有BHLH结构域，并广泛存在于植物中的一类重要转录因子。迄今已在不同植物物种中鉴定得到600余个BHLH转录因子，如在拟南芥和水稻中分别鉴定出162和167个BHLH转录因子[7-8]。已报道BHLH转录因子家族参与调控植物根毛形成、花青素积累、表皮发育及逆境响应等生物学过程[9-10]。现今关于BHLH转录因子参与调控植物盐胁迫响应及耐盐性的相关研究已有一些报道。如已报道番茄中的BHLH类转录因子SlICE1a盐胁迫诱导表达，将该基因在番茄中过量表达，发现转基因植株现体内可溶性糖、脯氨酸和LEA蛋白含量增加，耐盐性得到增强[11]。野生稻中克隆得到了两个盐胁迫诱导的BHLH类转录因子OrbHLH2和OrbHLH001，分别将其在拟南芥中过量表达发现转基因植株对盐胁迫及渗透胁迫有较好抗性[12-14]。前期从甜菜中克隆得到了甜菜BvBHLH92基因，本研究对BvBHLH92基因的系统发育、组织表达以及亚细胞定位进行了分析，为进一步确定BvBHLH92基因的功能奠定了重要基础。

1 实验部分

1.1 BvBHLH92蛋白的序列分析

利用序列分析软件DNAMAN及BIOEDIT对BvBHLH92的基因及蛋白序列进行分析，主要分析内容为BvBHLH92蛋白的分子量、等电点。通过Genbank和SWISS-PROT数据库对BvBHLH92蛋白的功能结构域进行预测。

1.2 BvBHLH92蛋白的系统发育分析

首先从Genbank、SWISS-PROT及UniProt数据中下载水稻、拟南芥及甜菜中相关的BHLH转录因子的蛋白质序列，将下载后的蛋白序列数据进行统一搜集整理，并利用ClustalX软件进行多重序列比对，剔除系统发育构建中的无关冗余序列。利用MEGA 4 ( Molecular Evolutionary Genetics Analysis)软件对多重序列比对的数据进一步分析，并构建系统发育树(Neighbor-Joining法)。

1.3 BvBHLH92基因的组织表达分析

利用TRIZOL(Invitrogen) 试剂提取甜菜根、茎、叶及花等部位的总RNA，并利用紫外分光光度计对提取的总RNA的浓度及吸光值进行测定。提取的总RNA质检合格后，利用TAKARA公司的试剂盒1 μL 总RNA进行反转录反应及合成cDNA第一链，具体实验操作过程见说明书。 荧光定量PCR主要利用BioRed公司荧光定量PCR仪及试剂进行荧光定量PCR反应，以甜菜18SRNA基因作为内参，分析BvBHLH92基因在甜菜各组织部位的相对表达量进行分析。18S-s: 5′-TGACGGAGAATTAGGGTTCG-3′，18S-as: 5′-CCCCAATGGATCCTCGTTA-3′。

1.4 BvBHLH92基因响应盐胁迫的组织表达分析

将培养15 d的甜菜 (BetaVulgaris) 幼苗进行300 mM NaCl 胁迫培养，实验中添加的NaCl共分3d加入甜菜幼苗培养液中。分别在甜菜幼苗进行300 mM NaCl 处理0、1、2、3、4、5、6、7 d后，收获甜菜幼苗的根及叶，并进行总RNA提取、反转录及荧光定量PCR反应，具体步骤同上。

1.5 BvBHLH92基因的亚细胞定位分析

将BvBHLH92基因cDNA编码区序列构建到N端带有RFP荧光蛋白的pCAMBIA1300载体上。同时，将构建好的pCAMBIA1300-BvBHLH92-RFP植物表达载体电转化进入农杆菌EHA105，鉴定得到阳性克隆。将阳性转化pCAMBIA1300-BvBHLH92-RFP农杆菌菌株，于28 ℃震荡培养过夜，将过夜培养的菌液在4 000 r/min的条件下，离心15 min进行集菌收集，弃上清，用烟草转化液(ddH2O 98 mL，1M MES 1mL，1 M MgCl21 mL，0.2 M乙酰丁香酮 100 μL pH=5.6)重悬菌，在2 mL的离心管中加入1 mL的烟草转化液，接一定量的菌体重悬于烟草转化液中，使菌体OD600于0.7～1.0。将重悬的菌液在28 ℃条件下静置培养2 h后，进行烟草注射。注射完成后，将烟草置于空盘中，并浇上适量的水，在温室中恢复培养2～4 d后进行荧光观察。

2 结果与讨论

2.1 BvBHLH92基因及蛋白的序列分析

BvBHLH92基因组序列全长为3 013 bp，其编码区的cDNA全长为678 bp，编码225个氨基酸。对编码蛋白进行序列分析预测BvBHLH92蛋白的分子量为25 135.5 Da，等电点为pI=8.70。通过蛋白结构域分析，发现BvBHLH92蛋白的49～102位氨基酸可形成Helix-loop-helix DNA-binding (HLH)结构域，该结构域是BHLH转录因子基因家族的典型功能结构域，其主要功能是参与结合下游基因启动子上游的E-box/G-box顺式作用原件。此外，79～129位氨基酸还可形成Basic leucine zipper 结构域 (bZIP)，该结构域主要参与蛋白二聚体的形成以及下游DNA的结合。 通过以上分析可以明确BvBHLH92蛋白含有BHLH转录因子基因家族的典型结构功能域，表明该基因可能具有调控甜菜相关基因表达的功能。

图1 甜菜BvBHLH92的系统发育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of sugar beet BvBHLH92

2.2 BvBHLH92蛋白的系统发育分析

为深入研究BvBHLH92蛋白的系统发育情况，构建了甜菜BvBHLH92蛋白及水稻和拟南芥其他BHLH转录因子的系统发育树 (图1)。发现甜菜BvBHLH92蛋白与甜菜BvBHLH93基因亲缘关系最近。同时，BvBHLH92蛋白与拟南芥BHLH转录因子AtBHLH92同样具有较近的亲缘关系，表明该蛋白命名为BvBHLH92较为准确。此外，分析发现BvBHLH92、BvBHLH93及AtBHLH92单独组成了一个clade，其中AtBHLH92基因被报道参与调控拟南芥的盐胁迫响应变化，并且该基因在盐胁迫下强烈诱导表达，因此推测BvBHLH92基因可能受到盐胁迫诱导表达。

2.3 BvBHLH92基因的组织表达分析

图2 BvBHLH92基因的组织表达分析Fig.2 Tissue location pattern of BvBHLH92

利用荧光定量PCR技术对BvBHLH92基因在甜菜根、茎、叶及花等组织部位的表达情况进行分析。研究发现BvBHLH92基因在甜菜花部位表达量最高，其次在甜菜叶中有一定量的表达，而在甜菜根和茎部表达量最低 (图2)。BvBHLH92基因的表达情况与拟南芥AtBHLH92的表达情况较为相似，AtBHLH92基因在拟南芥的根部表达量最低，在花部位表达量最高。推测转录因子BvBHLH92参与调控花部位相关基因的表达，可能参与调控甜菜花部位响应盐胁迫的生理响应变化。

2.4 BvBHLH92基因响应盐胁迫的组织表达分析

为确定BvBHLH92基因是否与拟南芥AtBHLH92基因类似响应盐胁迫诱导表达。采用荧光定量PCR技术分析BvBHLH92基因在盐胁迫甜菜根和叶片中的表达情况(图 3)。研究发现甜菜叶片盐胁迫4 d后BvBHLH92表达量最高，而后随着盐胁迫时间的延长，BvBHLH92表达量逐渐降低(图3(a))。然而甜菜根部盐胁迫3 d后BvBHLH92基因的表达量最高(图3(b))，以上结果表明甜菜根和叶片在盐胁迫下BvBHLH92基因响应盐胁迫的变化程度以及其响应时间均存在差异，推测在盐胁迫下BvBHLH92基因在根和叶中行使的功能存在一定程度差异。

图3 BvBHLH92基因盐胁迫下表达变化分析Fig.3 Analysis of BvBHLH92 gene expression changes under salt stress

2.5 BvBHLH92基因的亚细胞定位分析

利用烟草瞬时表达体系发现BvBHLH92蛋白主要定位在细胞核(图 4)，表明转录因子BvBHLH92蛋白的主要在细胞核中行使功能。目前报道的绝大多数BHLH类转录因子均定位在细胞核中，参与调控植物生长发育过程中的许多生命过程。推测BvBHLH92的主要功能是在细胞核中调控下游基因在转录水平的表达，进而调控甜菜在盐胁迫下的响应变化。

图4 BvBHLH92蛋白的亚细胞定位分析Fig.4 Subcellular localization of BvBHLH92

3 结 论

1)BvBHLH92蛋白含有BHLH转录因子基因家族典型的HLH和bZIP结构域，属于甜菜BHLH类转录因子家族的成员。

2)BvBHLH92蛋白与甜菜及拟南芥BHLH类转录因子BvBHLH93及AtBHLH92亲缘关系较近。

3)BvBHLH92基因在甜菜的花部位表达量较高，并且在甜菜的根和叶等部位响应盐胁迫诱导表达，但BvBHLH92在甜菜根和叶部位的诱导表达在强度及时间上存在一定差异。

4)BvBHLH92蛋白主要定位在细胞核，这与BHLH类转录因子在细胞核中行使功能较为吻合，表明BvBHLH92在细胞核中参与调控下游基因表达。

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Sugar beet BvBHLH92 tissue expression and subcellular localization

WANG Yu-Guanga， LI Hai-Yingb，c，d，*

(HeilongjiangUniversitya.CropAcademy;b.CollegeofLifeSciences;c.KeyLaboratoryofMolecularBiology，CollegeofHeilongjiangProvince;d.EngineeringResearchCenterofAgriculturalMicrobiologyTechnology，Harbin150080，China)

TheBvBHLH92 gene was cloned from sugar beet. Meanwhile， the sequence， tissue expression and subcellular localization of the BvBHLH92 were analyzed. BvBHLH92 protein contains 225 amino acids and has a typical functional domain of BHLH transcription factor gene family. Furthermore， phylogenetic analysis showed that BvBHLH92 protein was close to BvBHLH93 and AtBHLH92， and tissue expression analysis indicated that the expression ofBvBHLH92 gene was highest in the flower， and the lowest expression in the root. At the same time，BvBHLH92 gene was induced by salt stress in sugar beet roots and leaves. Finally， we found that BvBHLH92 protein localized in the nucleus， suggesting that BvBHLH92 gene would regulate the related genes expression， and then participate in the regulation of salt stress response in sugar beet.

BHLH; transcription factor; subcellular localization；salt stress

10.13524/j.2095-008x.2017.03.040

Q943.2

A

2095-008X(2017)03-0045-05

2017-08-17

国家自然科学基金资助项目(31471552， 31701487)；黑龙江省自然科学基金资助项目(C2016048)

王宇光(1985-)，男，黑龙江齐齐哈尔人，助理研究员，博士，研究方向：植物分子生物学，E-mail：wangyuguang0920@hotmail.com;*

李海英(1968-)，女，黑龙江肇东人，教授，博士，博士研究生导师，研究方向：植物分子生物学， E-mail：lvzh3000@sina.com。