ROCK2在癫痫大鼠海马区的表达①

梁 婷,王淑秋

(佳木斯大学基础医学院病理生理教研室，黑龙江 佳木斯 154007)

ROCK2在癫痫大鼠海马区的表达①

梁 婷,王淑秋

(佳木斯大学基础医学院病理生理教研室，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：探讨氯化锂-匹鲁卡品诱导SD大鼠癫痫(epilepsy)急性发作时，ROCK2蛋白在癫痫大鼠海马区的表达情况，进一步阐明癫痫的发病机制。方法：选取正常雄性SD大鼠30只作为研究对象，模型组拟于腹腔内注入氯化锂-匹鲁卡品诱发癫痫大鼠模型，实验组拟于腹腔内注入wortmannin抑制剂抑制PI3K/Akt信号通路，正常组拟于腹腔内注入等量生理盐水做对照。取材后，采用免疫组织化学方法检测大鼠海马各区ROCK2的表达，Spass17.0进行统计学分析。结果：(1)与正常组相比,模型组的ROCK2在海马各区(CAI区,CA2区,CA3区)呈高表达(P<0.05)。(2)与正常组相比,实验组的ROCK2在海马各区(CAI区,CA2区,CA3区)呈高表达(P<0.05)。(3)与模型组相比,实验组的ROCK2在海马各区(CAI区,CA2区,CA3区)呈低表达(P<0.05)。结论：(1)癫痫的发病过程中，ROCK2的异常高表达，提示其参与了癫痫的发病过程。(2)抑制PI3K/Akt信号通路，ROCK2的表达下降,提示二者之间存在着某些调控关系，然其具体机制有待进一步深入研究发现。

癫痫;SD大鼠;氯化锂-匹鲁卡品;ROCK2蛋白

癫痫是世界性脑部恶疾，其复杂的病理生理学机制至今仍不明确。现代研究发现，癫痫的发病中存在着神经元细胞变形，凋亡，缺失，重塑等形态学改变。Rho/ROCK2信号通路在细胞骨架蛋白的合成、降解、移动和收缩及细胞的迁移、增殖和存活等发挥着关键性的作用，调控着细胞骨架及其形态的异质性。本实验拟以氯化铝-匹鲁卡品诱导SD大鼠癫痫急性发作模型，wortmannin抑制PI3K/Akt信号通路，通过HE染色及免疫组化观察大鼠海马区神经元细胞形态学并监测其ROCK2的表达情况。探讨癫痫急性发作时，阻断PI3K/Akt信号通路对ROCK2的表达是否有影响，初步揭示PI3K/Akt与Rho/ROCK2信号通路在癫痫发作过程中的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器

正常雄性SD大鼠(购自佳木斯大学动物中心);ROCK2多克隆兔抗鼠抗体为(Santa生物技术公司);羊抗兔二抗(博士德公司)，即用型SABC免疫组化试剂盒(博士德公司)、DAB显色剂(博士德公司);石蜡包埋机(俊杰电子有限公司)、切片机(俊杰电子有限公司)、恒温水浴箱(保恒恒温技术有限公司)、普通光学显微镜(BH-Z日本Olympus公司)。

1.2 分组与给药

健康雄性SD大鼠30只，体重(170±20)g，24h自由饮食，随机分为3组(n=10)后，拟以腹部注药法诱导癫痫大鼠模型。第一天的中午13点钟测大鼠体重，开始给予各组大鼠相应药物注射。(1)对照组：将等量生理盐水以相同于实验组、模型组的各时间点、注射部位、注射方法、用药剂量进行处理。(2)模型组：腹腔注入氯化锂(3mmol/kg)预处理，19h后注入与wortmannin等量的生理盐水,1.5h后皮下注入硫酸阿托品(1mg/kg),再0.5h后腹腔注入匹鲁卡品(80mg/kg)。(3)实验组(wortmannin抑制剂组)：腹腔注入氯化锂(3mmol/kg)预处理,19h后腹腔注入wortmannin(1mg/kg)，1.5h后皮下注入硫酸阿托品(1mg/kg),再0.5h后腹腔注入匹鲁卡品(80mg/kg)。按Racine分级[1]判断模型是否制备成功。如果大鼠无癫痫发作或发作未至Ⅳ级标准，可以每隔30min再次腹腔注入匹罗卡品1次，最大注射剂量不超过60mg/kg。癫痫发作1h后根据分组情况腹腔注入 10%水合氯醛(350mg/kg)控制发作，正常组代以等量生理盐水。30min后仍有发作者，行原剂量二次注入1次。终止发作6h后取材。

1.3 取材与标本制备

癫痫发作终止6h后，给予10%水合氯醛(0.4mL/kg)过量麻醉大鼠，掐尾部无反应表示麻醉成功。俯卧位将大鼠固定于操作台上，眼科剪刀开胸后分离心包，于左心室动脉导管尖端心尖部行主动脉插管，后剪开右心耳。匀速注入0.9%生理盐水约50mL，待心耳开口处流出透明色生理盐水时改换为4%多聚甲醛行灌流固定，若大鼠呈现抽搐即停止固定。随后，于冰上将大鼠开颅取脑，并置于多聚甲醛溶液中再次固定。48h后将脑组织行石蜡包埋，切片机行冠状连续切片，切至所需海马组织，每例连续切片15张，厚度为5μm，充分展片于防脱载玻片上，置入恒温烘干箱中拷片2h，取出后无灰尘存放，每例随机抽取6张切片分别进行HE及免疫组化实验。

1.4 组织学观察

①HE染色 将切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，伊红-苏木素染色，梯度酒精透明透明，封片。镜下观察各切片海马区细胞结构。②免疫组化 将切片行二甲苯脱蜡，酒精脱水，枸橼酸盐溶液微波热修复，适量BSA封闭后37℃孵育，随后加ROCK2一抗4℃冰箱过夜，次日依次加入二抗、SABC、DAB显色剂后，经复染，风化，透明后封片。电镜下监测海马各区神经细胞中ROCK2的表达(一抗的阴性对照为PBS)。各标本随机取5张切片，分别随机取5个不重复的视野，对阳性细胞进行计数，取均值作为该标本结果，以每组5例样本观察结果的均值作为该组的实验结果。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠行为学观察 除正常组组外，其余大鼠基本达到Ⅳ级以上癫痫发作水平。且持续发作30 min 以上，癫痫模型组大鼠不明原因死亡2只，未达发作标准2只，均行随机替补，共计造模成功16只，成功率为80%。

2.2 HE染色结果 可见正常组大鼠海马各区多层神经元紧密排列，胞体、胞核、核仁均正常。模型组与实验组大鼠海马神经元密度降低、排列散乱，形态不规则，胞体缩小、可见神经元间隙明显增宽，部分神经元细胞胞核高度染色、固缩甚至消失；神经元严重变形、变性、坏死。见图1。

正常组(×400)

模型组(×400)

实验组(×400)

图1 各组大鼠海马区域神经元细胞HE染色结果

2.3免疫组织化学染色结果

可见各实验分组中，在海马区神经元细胞的胞浆、胞膜和胞核中，ROCK2均有不同程度的表达(棕黄色颗粒者)。对比正常组，模型组与实验组中表达ROCK2的阳性细胞数均显著增多(P<0.05),提示其参与了癫痫的发作；当特异性的抑制PI3K/AKT信号通路之后，对比模型组，实验组中表达ROCK2的阳性细胞数有所下降(P<0.05),表明ROCK2可能为PI3K/AKT信号通路的下游信号分子。见图2、图3。

正常组(×400)

模型组(×400)

实验组(×400)

图2 各组大鼠海马区域神经元细胞ROCK2的表达情况

图3 ROCK2蛋白在各组在鼠海马区的表达量

注：与正常组相比，ROCK2高表达，#P<0.05，差异性明显；与模型组相比，ROCK2的表达有所下降，*P<0.05，差异性明显。

3 讨论

以往研究表明，同为细胞骨架蛋白的Rho/Rho激酶和GFAP信号转导通路被激活后，轴突生长锥塌陷，轴突的生长、再生过程被抑制，导致癫痫发作[2]。神经元肌动蛋白稳定性下降，轴突生长锥体积增加延长，这一变化在Rho激酶的活性受抑制之时表现尤为突出[3]。PI3K/Akt[4]与MEK/ERK1/2[5]均为人体内重要的信号传导通路，促进神经元的存活并具有肯定的抗凋亡作用。本研究发现：在模型组与实验组中，ROCK2均呈现显著性高表达，提示其参与了癫痫的发病过程；同时当实验组中PI3K/Akt信号通路被抑制时，相比较模型组，ROCK2的表达有所下降，提示在癫痫的发病过程中，其可能为PI3K/Akt通路的下游信号分子。然而新近证实PTEN(一种磷酸酶)为ROCK的一种底物，可以通过ROCK而被激活，同时其为PI3K上游区域的一个负性调节蛋白，与细胞生长调节，蛋白质合成，转录子调节及细胞存活有关[6]。在HEK细胞中，ROCK激酶活性增高可通过PTEN介导而降低Akt蛋白的磷酸化[7]。有文献表明，ROCK抑制剂通过削弱缺血再灌注引起的Bcl-2下调及激活PI3K/Akt/eNOS途径来发挥保护心脏的功效，这种保护作用可以被PI3K抑制剂 LY294002完全阻断；在内皮细胞，PI3K激活蛋白酶Akt，导致NO产生，起到扩张血管的作用[8]，同时内皮细胞的ROCK通过抑制PI3K来减少NO产生，而对后者的抑制作用更显著[9]。由此可见，PI3K/Akt信号通路与Rho/ROCK2信号通路之间存在着复杂的正负反馈调节环路。然而，在癫痫的发病过程中是否也存在着这一复杂的调节环路，有待进一步研究发现，这为后续研究癫痫的发病机制提供了新的思路。

[1]陈雅岚，李杰，徐馨，等．黑皮质素受体-4在癫痫模型大鼠脑组织中的表达及相关机制[J].第三军医大学学报,2014,36(24):2445-2450

[2]聂磊，王海燕，李春玉，等．左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织GFAP及5-HT2A受体表达的影响[J].黑龙江医药科学,2015,38(2):26-28

[3]Wong K, Ren XR, Huang YZ, et al .Signal transduction in neuronal migration: roles of GTPase act ivating proteins and the small GTPase Cdc42 in the Slit-Robo pathway[J]. Cell,2001,107(2):209-221

[4]史志勤，王维平，于江华，等．重组人红细胞生成素经PI3K/Akt途径对大鼠癫痫持续状态诱导的神经元凋亡的保护作用[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2009,18(1):94-102

[5]栾倩，刘蕾，刘君星，等.灵芝酸对痫样放电海马神经元2磷酸化ERK1/2水平的影响[J].黑龙江医药科学,2014,37(2):1-3

[6]Di Cristofano A, Pandolfo PP. The Multiple Roles of PTEN in Tumor S uppression[J]. Cell, 2 000,100(4):387-390

[7]Li Z, Dong X, Wang Z, et al. Regulation of PTEN by Rho small GTPases[J]. Nat Cell Biol, 2005,7(4):399-404

[8]Steven K F, Farzaneh A S, Galen V H, et al. Increased leukocyte ROCK activity in patients after acute ischemic stroke[J]. Brain Research, 2009,27:89-93

[9]Gorkem T, Sevtap K, Beril Y, et al. Heterogeneous appearance of VEGF (vascular endothelial growth factor) immunopositivity in cyst capsules of endometrioma[J]. Acta Histochemica, 2009,11(1):61-67

佳木斯大学研究生创新科研项目，编号：LM2015_009。

梁婷(1989～)女，山西吕梁人，在读硕士研究生。

王淑秋(1957～)女，黑龙江佳木斯人，学士，教授，博士研究生导师。E-mail:Wang_shuq@163.com。

R742.1

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1008-0104(2017)06-0071-03

2016-11-25)