过表达SecS对H2O2诱导大鼠H9c2心肌细胞氧化损伤的保护性作用①

吕思勉，栾卓诚，孙晗嫣，孙晗然，葛堂栋

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

过表达SecS对H2O2诱导大鼠H9c2心肌细胞氧化损伤的保护性作用①

吕思勉，栾卓诚，孙晗嫣，孙晗然，葛堂栋

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：探讨SecS在H2O2诱导大鼠H9c2心肌细胞氧化损伤中的保护性作用。方法：根据转染及H2O2处理情况将H9c2心肌细胞分为4组：正常对照组，SecS过表达组，H2O2处理组和SecS过表达+H2O2处理组。MTT法检测各组细胞存活率，酶标仪检测SOD活性和MDA水平。结果：与正常对照组比， H2O2处理组细胞存活率明显下降(P<0.01)，SOD活性明显降低(P<0.05)，MDA水平明显升高(P<0.01)；与H2O2处理组相比，SecS+H2O2组细胞存活率明显上升(P<0.05)，SOD活性明显上升(P<0.05)，MDA水平显著降低(P<0.05)。结论：过表达SecS能够对抗H2O2引起的心肌细胞损伤，提高大鼠H9c2心肌细胞抗氧化能力，对心肌细胞氧化损伤有一定的保护作用。

SecS；氧化应激；心肌细胞

氧化应激与缺氧再灌注损伤等引起的心肌损伤密切相关，伴随应激产生的活性氧或氧自由基是导致心肌细胞凋亡的重要原因[1]。硒是人体和动物维持生命所必需的微量元素之一，在机体内主要发挥抗氧化作用[2]。研究发现，缺硒能够引起心肌细胞氧化损伤和凋亡，但致病机制仍不清楚。硒在体内主要以硒代半胱氨酸的形式进入硒蛋白而发挥作用。目前，人体内已发现25种硒蛋白。这些硒蛋白主要包括谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidases，GPxs)类、硫氧还蛋白还原酶类(thioredoxin reductases，Txnrds)以及脱碘酶类(iodothyronine deiodinases，Dios)[3]。在人体内，硒代半胱氨酸的合成需要三个步骤，其中最后一步反应由SecS酶(O-phosphoseryl-tRNA:selenocysteinyl-tRNA synthase，SecS)催化[4]。SecS又称为SEPSECS，以磷酸吡多醛为辅酶，主要存在于肝脏、肺、肾脏以及心脏等部位，其它组织中也有少量表达。研究发现，SecS编码基因突变能够导致进行性脑萎缩(Progressive cerebellocerebral atrophy，PCCA)或克罗恩病(Crohn’s Disease，CD)显示SecS基因变异可能与脑部及肠道炎性疾病关系密切[5, 6]。但是，SecS酶是否在心肌细胞中发挥重要作用尚无报道。本研究通过在大鼠H9c2细胞中过表达SecS并检测各组细胞存活率、抗氧化能力以及脂质过氧化水平，以观察其对H2O2诱导的心肌细胞氧化损伤的保护性作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

大鼠H9C2 细胞株购于中国科学院上海细胞库。SecS过表达载及LipofectamineTM 2000转染试剂体购自Invitrogen公司，SecS抗体购于Proteintech公司，MTT检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司，SOD和MDA检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

大鼠H9c2细胞接种于含有适量DMEM培养液的培养皿中，置于37℃，含5% CO2培养箱内贴壁培养，每隔2d以1:3比例传代。

1.2.2 转染与分组

提前一天将细胞以5×105的接种量接种于六孔板，培养24h后，利用LipofectamineTM 2000将pCDNA3.1-SecS及pCDNA3.1空载体转染到H9c2细胞，培养48h后，加入400μmol/L的H2O2继续培养12h。根据转染及H2O2处理情况将H9c2细胞分为4组：正常对照组(NC)，SecS过表达组(SecS)，H2O2处理组(NC+H2O2)，SecS过表达+H2O2处理组(SecS+H2O2)。

1.2.3 Western blot印迹检测

提取H2O2处理后的各组细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量，取蛋白样品40μg，SDS-PAGE电泳后，转PVDF膜，脱脂奶粉封闭2h，SecS抗体(1:1000稀释)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，辣根过氧化物酶标记的二抗(1:10000稀释)室温孵育2 h，凝胶成像系统成像。以GAPDH为内参，分析目的蛋白表达水平。

1.2.4 MTT法检测H9c2细胞存活率

将各组细胞接种于96孔板，经H2O2处理12h后，加入20μL MTT(终浓度为5 mg/mL)，继续培养4h后，弃掉上清液，加入150μL二甲基亚砜，震荡溶解结晶物，用酶标仪检测560 nm处的吸光度值。

1.2.5 SOD和MDA检测

SOD活性和MDA水平检测按照试剂盒说明书进行。其中，SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA水平检测以硫代巴比妥酸为底物，酶标仪分别检测532nm和450nm处吸光度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计学分析，采用方差分析，各组两两比较用LSD检验。P<0.05为差异显著有统计学意义。

2 结果

2.1 转染前后H9c2心肌细胞SecS蛋白表达水平检测

将pCDNA3.1- SecS过表达载体转染H9c2心肌细胞，同时转染空载体最为对照。结果显示，与空白对照组(NC)以及空载体组(vector)相比，转染pCDNA3.1- SecS组SecS蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，显示载体构建成功。见图1。

图1 转染前后H9c2心肌细胞SecS蛋白表达水平*P<0.01

2.2 过表达SecS对H9c2心肌细胞存活率的影响

与正常对照组相比，过表达SecS后心肌细胞存活率无明显变化；加入400μmol/L的H2O2作用12h后，细胞存活率明显下降(P<0.01)；与H2O2处理组相比，过表达SecS组细胞存活率由58.30%±0.56%上升至77.23%±0.63%(P<0.05)，显示过表达SecS能够显著提高氧化损伤后的H9c2心肌细胞存活率。见图2。

图2 过表达SecS对H9c2心肌细胞存活率的影响

**P<0.01；#P<0.05。

2.3 过表达SecS对H9c2心肌细胞SOD活性的影响

与正常对照组相比，过表达SecS后心肌细胞SOD活性无明显变化；经400μmol/L的H2O2处理12h后，SOD水平降至空白对照组的55.57%(P<0.05)；与H2O2处理组相比，过表达SecS组心肌细胞SOD活性明显(P<0.05)。结果显示，过表达SecS能够明显提高H9c2心肌细胞主要抗氧化酶活性，增强细胞抗氧化能力。见图3。

图3 过表达SecS对H9c2心肌细胞SOD活性的影响

*P<0.05；#P<0.05。

2.4 过表达SecS对H9c2心肌细胞MDA水平的影响

与正常对照组相比，过表达SecS后H9c2心肌细胞MDA水平无明显变化；经400μmol/L的H2O2处理12h后，MDA水平升高3.39倍(P<0.01)；与H2O2处理组相比，过表达SecS组H9c2心肌细胞MDA水平显著下降(P< 0.05)。结果显示，过表达SecS能够降低氧化损伤后心肌细胞应激水平。见图4。

图4 过表达SecS对H9c2心肌细胞MDA水平的影响

**P<0.01；#P<0.05。

3 讨论

研究发现，过量氧自由基或活性氧(reactive oxygen species，ROS)导致的氧化应激水平升高与很多心血管疾病发生发展过程关系密切，如心肌肥大、心衰、心梗以及缺血再灌注损伤[7]。氧自由基主要由线粒体产生，就心脏而言，线粒体约占30%，因此心脏极易产生氧化损伤。氧化应激极易导致脂质过氧化的发生，随着脂质过氧化反应加剧，氧化产物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平随之增高[8]。MDA含量是脂质过氧化的一个常用指标，能够反映细胞膜脂过氧化的程度。为降低氧化损伤程度，线粒体内进化出一套完整的抗氧化体统，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、NADH、谷胱甘肽过氧化物酶等。SOD活力能够间接反应细胞清除活性氧的能力，是判断细胞抗氧化能力的一个常用指标。

硒是人体所必需的微量元素之一，通常以硒代半胱氨酸的形式进入硒蛋白而发挥作用，其中以谷胱甘肽过氧化物酶抗氧化作用最为明显。目前，硒对心肌细胞的保护性机制仍不清楚。本研究通过过表达硒蛋白合成路线上游的关键酶SecS，观察其在H2O2诱导的大鼠H9c2心肌细胞氧化损伤中的保护性作用。结果显示，过表达SecS能够增加H2O2引起的H9c2心肌细胞存活率，提高以SOD为代表的抗氧化酶活性，降低细胞脂质过氧化水平，显示SecS酶在心肌细胞氧化损伤时发挥重要作用。因此，进一步研究硒蛋白合成过程中的关键因子与心脏功能的关系，阐明硒缺乏引起心肌细胞氧化损伤的分子机制，仍是我们亟待解决的问题。

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[2]Brown KM, Arthur JR. Selenium, selenoproteins and human health[J]. Public Health Nutr，2001, 4(2): 593-599

[3]Frederick P, BELLINGER I, Arjun V, et al. BERRY Regulation and function of selenoproteins in human disease[J]. Biochem J，2009, 422(1):11-22

[4]Turanov AA, Xu XM, Carlson BA, et al. Biosynthesis of selenocysteine, the 21st amino acid in the genetic code, and a novel pathway for cysteine biosynthesis[J]. Adv Nutr,2011, 2(2):122-128

[5]Agamy O, Ben Zeev B, Lev D,et al. Mutations disrupting selenocysteine formation cause progressive cerebello-cerebral atrophy[J]. Am J Hum Genet，2010, 87(4): 538-544

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[7]Madamanchi NR, Runge MS. Redox signaling in cardiovascular health and disease[J]. Free Radic Biol Med，2013, 61:473-501

[8]蔡纲, 黄平, 李绍民. 翻白草对CCl4所致慢性肝损伤大鼠肝组织中SOD、MDA、GSH水平的影响[J]. 黑龙江医药科学, 2016, 39(1):33-36

黑龙江省大学生创新创业训练计划项目，编号：201610222032。

吕思勉(1996 ～)女，黑龙江佳木斯人，在读本科生。

葛堂栋(1979 ～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，讲师。E-mail: getangdong@163.com。

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