胞外膜泡与系统性硬化病的关系及应用展望

朱佳宁 薛静

310009杭州，浙江大学医学院附属第二医院风湿免疫科

·综述·

胞外膜泡与系统性硬化病的关系及应用展望

朱佳宁 薛静

310009杭州，浙江大学医学院附属第二医院风湿免疫科

胞外膜泡（extracellular vesicles）具有多种生理病理功能，可介导细胞间的通讯，参与炎症、免疫信号通路、血管生成、应激反应、细胞衰老、增殖和分化等过程，在自身免疫反应的诱导、维持、调节中也起重要作用［1］。系统性硬化病（systemic sclerosis，SSc）是以皮肤纤维化、胶原增殖及血管病变为特点的全身多系统自身免疫性疾病，临床表现呈现很大的异质性，病理生理特征是内皮细胞异常激活、凋亡以及血管生成细胞数量减少，使新血管的生成受损；以血管壁炎症和凝血系统激活为特点的血管损伤在疾病的早期发生，并且是发病机制的核心［1⁃3］。本文旨在探讨胞外膜泡在SSc病理机制中的作用及其潜在的临床应用价值。

一、概述

胞外膜泡主要包括两种形式：直接从不同细胞的细胞膜脱落的微粒（cell⁃derived microparticles，microparticles）以及多泡体与细胞膜融合后释放的胞外体（exosomes）［1］。二者体积不同，形成机制及来源细胞各异，并在不同的生理或免疫环境中履行不同的生物学功能（表1）。

体内微粒（100 nm～1 μm）可来源于许多不同种类细胞，较常见的有血小板、内皮细胞、白细胞、树突细胞等［1，4］。微粒往往来源于细胞膜的直接脱落，通常认为其表达的膜成分磷脂酰丝氨酸（phosphatidyl serine）是其一种特征性分子标记物，参与凝血酶复合物的形成以及网状内皮系统清除衰老细胞的过程。也有研究发现，并非所有微粒均表达磷脂酰丝氨酸，说明其形成机制中仍有异质性［1］。微粒的膜结构成分还可反映其细胞来源，例如CD41（糖蛋白GpⅡb/Ⅲa）可特异性标记血小板来源的微粒，CD235a（血型糖蛋白）标记红细胞来源的微粒；应用针对微粒起源细胞表面特异性抗原成分的抗体也可识别其具体亚型，检测微粒所包含的功能性细胞黏附因子、生物活性磷脂、胞质成分和各种抗原也可证明其来源细胞以及接收的刺激类型［1］。目前最常用来检测微粒的方法是流式细胞仪，主要优势是可对微粒所表达的生物标志进行双标或多标染色以确定细胞来源及生物功能［5］。

胞外体（50～100 nm的囊泡）可以自发生成或由不同类型细胞接受各种刺激诱导产生，其生化结构组成因细胞来源不同而呈现多样性。已知的锚定在胞外体膜表面的分子除黏附分子、跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81和CD82）、膜转运相关蛋白和主要组织相容性复合体（MHC）外，也可含有伴侣蛋白、细胞骨架蛋白、膜联蛋白、多泡体形成相关蛋白、RNA（mRNA、microRNA）和代谢酶（3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸激酶）等。细胞分泌的胞外体具有在细胞间转移蛋白质和核酸的功能，不仅在细胞间通讯中扮演了重要角色，同时在不同免疫应答反应中起重要作用，例如，从抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）脱落的某些细胞成分（如MHCⅠ、Ⅱ类复合物及相关多肽）被包被在胞外体内，可转移到其他树突细胞或T细胞，参与进一步免疫调节反应［1，6］。

表1 两种胞外膜泡的主要性质及功能对比

二、胞外膜泡与SSc

（一）微粒与SSc的关系：Guiducci等［4］研究发现，SSc患者血浆中微粒总量与改良的Rodnan皮肤厚度评分（MRSS）呈负相关，即微粒水平升高意味着SSc患者皮肤硬化程度较轻。伴有皮肤溃疡的患者微粒总量显著降低，且多变量分析表明，微粒总量的变异与患者年龄、C反应蛋白、MRSS评分、疾病亚型等相关。

有研究显示，血小板、内皮细胞、单核细胞、T淋巴细胞来源的微粒血浆浓度在SSc患者中升高，且在合并有肺动脉高压或间质性肺病的SSc患者中浓度更高［7］，反映出SSc患者中这些细胞被激活的同时释放微粒，微粒含量可能与肺部受累及疾病严重程度相关。Iversen等［8］应用多元回归分析发现，血浆中可溶性E选择素和P选择素的增多与弥漫皮肤型SSc患者内皮细胞来源的非结合膜联蛋白V（AnxV）微粒有相关性，而与血浆总体微粒水平无关。另外，鉴于肺间质病变为SSc中较为常见的内脏病变，Iversen 等［9］还于另一研究中证实，局限皮肤型SSc及弥漫皮肤型SSc患者中内皮细胞来源的AnxV阴性微粒和白细胞来源的AnxV阴性微粒的水平均与患者肺弥散功能、用力肺活量呈负相关，即与肺部受累严重度正相关，由此推测SSc患者中皮肤受累、肺部受累及其严重程度可能与微粒及相关细胞黏附分子（E、P选择素）等表达相关。也有研究表明，上述总体微粒水平在SSc患者中降低，但AnxV阴性微粒水平有所增加［8］。推测SSc中检测到总微粒减少的原因可能是微粒的清除增加或更多微粒黏附于有炎症反应的内皮细胞壁上；同时，胞外膜泡的提取、检测及分析缺乏标准化方法等也造成了这些研究结果的差异［1，7⁃8］。

1.血小板来源的微粒在SSc中的作用：血小板来源微粒是血液中微粒最常见类型［1，4］。不同类型细胞来源的微粒往往具有其母细胞特性，如血小板来源的微粒即具有血栓性和免疫学特性［10］。已有研究证据表明，血小板来源的微粒可能参与SSc发病机制，包括血管病变、内皮细胞活化及凝血激活［8］。

研究发现，SSc患者体内中性粒细胞产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多，激活细胞外高迁移率族蛋白1（HMGB1），也导致HMGB1从细胞质易位到细胞膜磷脂双分子层的外层，释放表达HMGB1的血小板来源微粒；同时HMGB1以可溶性分子形式与血小板膜或血小板来源微粒结合（HMGB1⁃微粒），直接或通过P选择素反馈作用于中性粒细胞，产生更多的ROS，进而介导自身免疫反应、纤维化和血管炎症等病理过程（图1）［11⁃12］。

已知SSc患者血清HMGB1水平升高与疾病严重程度如内脏器官受累及免疫学异常相关［13］；合并肺动脉高压或表现为弥漫进展性皮肤受累的SSc患者白细胞细胞膜结合的HMGB1水平明显增高，血小板来源微粒可作为SSc患者细胞坏死的原始信号HMGB1的来源，可能导致持续的微血管损伤和内皮细胞激活［12，14⁃15］。

2.内皮细胞来源的微粒在SSc中的作用：内皮细胞来源微粒标志着SSc患者分子水平的血管损伤，其不仅能反映内皮组织的损伤或激活，同时也在炎症调节、凝血过程和血管功能中发挥作用［2］。Kavian等［16］以此为依据对泛硫乙胺在SSc中的作用机制进行了一系列研究并发现了一些潜在的治疗SSc的新机制。在体外实验中，泛硫乙胺可下调肿瘤坏死因子（TNF）刺激的内皮细胞释放微粒，阻止微粒诱导的内皮细胞和成纤维细胞的氧化和硝化应激（nitrosative stresses）反应，还可修复SSc小鼠体内分离出的成纤维细胞的氧化还原平衡；在体内实验中，伴有皮肤和肺纤维化的SSc小鼠体内循环的微粒、氧化应激和血管内皮损伤的标记物水平升高，而使用泛硫乙胺或通过灭活三磷腺苷结合盒转运体A1可以抑制相关微粒的释放从而改善SSc小鼠皮肤症状及病理损害程度。另外，富含花生四烯酸的微粒可被血管生成细胞吞噬，继而通过激活酸性鞘磷脂酶诱导细胞凋亡，而抑制该类细胞的吞噬作用或抑制酸性鞘磷脂酶可以阻止血管生成细胞被微粒诱导凋亡，进而促进新生血管，抑制SSc相关的血管病变，因此也成为SSc可能的治疗靶点之一［3］。

图1 血小板及其来源的微粒、活性氧（ROS）、高迁移率族蛋白1（HMGB1）、中性粒细胞之间的关系 血小板活化使表达HMGB1的血小板来源的微粒释放，并通过P选择素反馈作用于中性粒细胞产生ROS；ROS氧化HMGB1，氧化形式的HMGB1激活中性粒细胞的能力增强，同时以可溶性分子的形式与血小板来源微粒结合，最终体内增多的ROS介导系统性硬化病中自身免疫反应、纤维化和血管炎症

最近一项研究用荧光光学成像量化SSc患者手掌各关节的炎症程度，发现内皮细胞微粒水平和荧光光学成像量化的血管周围炎症之间有明显的相关性，推测内皮细胞微粒可能成为SSc患者的辅助诊断和治疗监测的潜在临床标志物［2］。

（二）胞外体与SSc的关系：胞外体与SSc发病机制关系更为密切，其表达的某些分子亚基可被自身抗体识别从而导致免疫反应，因此在SSc自身抗体谱研究中尤为重要。人类胞外体复合物（PM/Scl复合体）抗体属于抗核仁抗体，主要表达在多发性肌炎-硬皮病重叠综合征患者和相关疾病患者中［17⁃19］。主要的人类胞外体复合物抗原（PM/Scl⁃75和PM/Scl⁃100）的自身抗体可出现在SSc患者血清中，而这两种自身抗体任一阳性均提示临床可能出现更严重的钙质沉着；PM/Scl⁃75和PM/Scl⁃100抗体双阳性的患者肌炎发生率增加；肺部受累则只与PM/Scl⁃75抗体相关，同时存在PM/Scl⁃100抗体的患者相对于其他抗体阳性有更好的生存率［20］。研究证实，PM/Scl⁃75在细胞凋亡过程中被特异性裂解，裂解后的N端残基保留了完整的RNase PH结构域，这一结构域即为人类胞外体复合物的核心。免疫系统持续接触高水平的细胞凋亡过程中产生的裂解后PM/Scl⁃75，会破坏机体对胞外体复合物的免疫耐受，产生自身抗体如U1snRNP⁃68［17］，并引发全身各系统一系列的病态免疫应答，因此胞外体形成是SSc免疫耐受失衡的重要机制之一。

如上所述，胞外体可表达的相关蛋白或分子较多，所有胞外体相关的蛋白质（MPP6，C1D，KIAA0052/hMtr4，hSki2和hSki8）都可作为特异性靶向抗原，其中C1D抗体在多发性肌炎⁃硬皮病重叠综合征患者血清中可被检测，且识别C1D的自身抗体在多发性肌炎-硬皮病重叠综合征患者中阳性率与PM/Scl⁃75c和PM/Scl⁃100抗体阳性率相近［21］。部分多发性肌炎⁃硬皮病重叠综合征患者体内可检测到C1D抗体，但PM/Scl抗体阴性。使用重组C1D作为抗原靶向检测自身抗体有助于多发性肌炎⁃硬皮病重叠综合征的诊断［21］。因此，进一步明确胞外体来源、性质和与疾病特异性及其临床亚型的关系，不仅有助于寻找疾病的标记，也为进一步寻找治疗靶点提供帮助。

三、胞外膜泡的应用展望

尽管微粒水平与SSc的相关性研究结果具有异质性，但是血小板来源的微粒和内皮细胞来源的微粒以及胞外体均在SSc的发病机制中起重要作用，它们对于评估病情、判断预后及发现可能的治疗靶点均有潜在价值。

不同来源及标记的胞外体行为学特征有较大的异质性，可作为疾病生物标志物、药物作用靶点或药物载体，在SSc中的应用目前均尚属初级探索阶段，有着广阔的发展前景。一些大型带电分子的生物药物不能跨越细胞膜到达作用靶点，而胞外体可以携带各种分子跨越生物屏障，如滑膜或血脑屏障，进而达到靶向及精准治疗目标［6］。与游离药物相比，胞外体携带的药物在血液中的形式更稳定，且生物同源性保证了其安全性。

内源性胞外膜泡可增强对外来抗原的免疫反应，抑制针对自身抗原的反应，因此APC来源的胞外膜泡或者从患者体内分离出的内源性胞外膜泡经特定分子修饰后可用于治疗自身免疫性疾病，为SSc治疗提供新的思路和方法［22⁃23］。近年来胞外膜泡形成、释放、被靶细胞摄取的分子机制被阐明，蛋白质组学、下一代测序、代谢组学这些先进技术都被用于研究胞外膜泡的结构组成、蛋白质翻译后修饰等生物学性质［1］。这些技术将进一步带动胞外膜泡相关研究方法的标准化以及精准性，更多的大样本研究将更准确地揭示各种类型胞外膜泡与SSc之间的关系，为其更好地应用于临床诊治打下基础。

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薛静，Email：jingxue@zju.edu.cn

国家自然科学基金（81102264）；浙江省医药卫生科技计划项目（2018KY422）

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.12.023

2016⁃12⁃06）

朱思维 颜艳）